过氧化物酶体增殖物激活受体γ在大肠肿瘤中的表

【摘要】 目的 在蛋白及mrna水平确定过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxiome proliferatoractivated receptorγ, pparγ)在大肠肿瘤中的表达。方法 结肠镜下活检标本,分为正常大肠粘膜组、大肠腺瘤组及大肠癌组,免疫组化及rtpcr方法检测各组pparγ的表达。
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【摘要】 目的 在蛋白及mrna水平确定过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxiome proliferatoractivated receptorγ, pparγ)在大肠肿瘤中的表达。方法 结肠镜下活检标本,分为正常大肠粘膜组、大肠腺瘤组及大肠癌组,免疫组化及rtpcr方法检测各组pparγ的表达。结果 正常大肠粘膜中表达pparγ蛋白的细胞主要是接近肠腔,分化良好的腺上皮细胞;而在大肠腺瘤中,pparγ阳性的细胞呈弥漫分布。pparγ蛋白及mrna在大肠癌中的表达显著增加,明显高于大肠腺瘤和正常大肠粘膜(p<0.05)。pparγ蛋白及mrna在正常大肠粘膜及腺瘤中的表达无差异(p>0.05)。pparγ mrna在重度异型增生腺瘤中的表达高于正常大肠粘膜(p<0.05),接近于在大肠癌中的表达(p>0.05)。结论 大肠腺瘤最先发生pparγ表达部位的变化,pparγ在重度异型增生的大肠腺瘤及大肠癌中的表达水平较高,表明pparγ可能在早期即参与大肠癌的发生发展。

【关键词】 过氧化物酶体增殖物激活受体γ 大肠腺瘤 大肠癌

大肠癌多数由大肠腺瘤演变而来,其发生的经典多步骤模式为“腺瘤—腺癌序列”。过氯化物酶体增殖物激活受体γ(peroxiome proliferatoractivated receptorγ,pparγ)是由配体激活的核转录因子ppars的一个亚型,与消化道肿瘤关系密切。wwW.bylw8.com有研究发现pparγ在大肠粘膜细胞中有表达,本研究旨在蛋白水平和mrna水平确定大肠肿瘤中pparγ的表达情况。

1 材料与方法

1.1 材料收集、分组 所有组织均取自北医三院消化科结肠镜下活检标本,并经病理诊断证实。正常大肠粘膜15例、大肠腺瘤16例及大肠癌上皮15例行免疫组织化学染色。正常大肠粘膜24例、大肠腺瘤58例(其中重度异型增生大肠腺瘤14例)及大肠癌上皮38例行rtpcr。

1.2 pparγ的免疫组化染色 组织取材后于福尔马林中固定、脱水、常规石蜡包埋、切片(厚4μm)→铺于多聚赖氨酸涂布的载玻片上→常规脱蜡至水→0.1m pbs浸泡5min→抗原修复(0.1m枸橼酸盐缓冲液预热至92℃~98℃,放入玻片,微波炉内92℃~98℃加热5min,自然冷却至室温)→0.1m pbs冲洗5min→3%过氧化氢孵育10min,消除内源性过氧化物酶活性→0.1m pbs冲洗5min→滴加封闭用正常山羊血清(北京中山生物科技公司),室温孵育15min,倾去→滴加1∶20稀释的鼠抗人pparγ单克隆抗体(一抗,santa cruz 生物技术公司,美国),4℃过夜。→0.1m pbs冲洗5min→滴加生物素标记羊抗小鼠igg(二抗,北京中山生物科技公司),37℃孵育15min→0.1m pbs冲洗5min→滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(北京中山生物科技公司),37℃孵育15min→0.1m pbs冲洗→dab显色,自来水充分冲洗→苏木素复染后封片。阴性对照用正常山羊血清代替一抗。

pparγ阳性反应表现为细胞核和胞浆呈棕褐色。每张切片选取3~5个视野,用《真彩色病理图像分析系统 4.0》(北航图像中心)对免疫组化染色结果进行分析,计算面密度(阳性目标总面积/统计场总面积),并进行统计。

1.3 rt pcr trizol(invitrogen公司)提取组织总rna,适量depc水溶解后,分光光度计(uv1601,shimadzu)测od260 及od280的值及电泳测定rna浓度及纯度;各取2μg的rna,impromiirt试剂盒(promega公司)将rna逆转录为cdna;taq dna聚合酶(北京泛基诺科技有限公司)作用下进行pcr反应(pcr仪为geneamp9700, 美国applied biosyetems公司)。反应条件见表1。

阴性对照不加逆转录酶,代以去离子水,余反应条件同前。

内参βactin及目的基因pparγ的pcr产物各6μl于1.5%琼脂糖凝胶75v/cm恒压电泳,eb染色后在紫外灯下观察,清晰见341bp和500bp的条带,在imagemaster凝胶成像系统仪(quantity 0ne,美国柯达公司)下分析。pparγ与βactin电泳条带灰度的比值代表各组pparγ的表达水平。

1.4 统计学分析

结果用±s表示。采用spss11.0软件分析。计量资料的组间比较采用单因素方差分析,p<0.05认为差异有统计学意义,p<0.01认为差异极具统计学意义。

2 结果

2.1 pparγ 蛋白在人正常大肠粘膜、大肠腺瘤及大肠癌中的表达

免疫组化结果显示:在正常大肠粘膜、大肠腺瘤及大肠癌中均有pparγ的表达。正常大肠粘膜组织中表达pparγ的细胞主要是接近肠腔、分化良好的腺上皮细胞,见图1a;而在大肠腺瘤组织中,pparγ阳性细胞的分布发生异常,分布的极性消失,呈弥漫分布,见图1b。pparγ蛋白在正常大肠粘膜及腺瘤中的表达差异无统计学意义(p>0.05)。 pparγ蛋白在大肠癌细胞中高表达,见图1c, 明显高于在大肠腺瘤及大肠粘膜中的表达 (p<0.01) ,见表2。表2 pparγ蛋白在正常大肠粘膜、大肠腺瘤及大肠癌中的面密度(阳性目标总面积/统计场总面积)

  2.2 pparγ mrna 在正常大肠粘膜、大肠腺瘤及大肠癌上皮中的表达

rtpcr结果显示:大肠癌中的pparγ mrna的表达水平最高,明显高于正常大肠粘膜和大肠腺瘤,与两者相比,差异均有统计学意义(p均<0.01);pparγ在正常大肠粘膜和大肠腺瘤中的表达差异无统计学意义(p>0.05),见表3,图2。

2.3 pparγ mrna在正常大肠粘膜、重度异型增生大肠腺瘤及大肠癌中的表达

rtpcr结果显示:重度异型增生腺瘤中pparγ mrna的表达高于正常大肠粘膜,两者间差异有统计学意义(p<0.05),但与大肠癌中pparγ的表达差异无统计学意义(p>0.05),见表4。表1 pparγ pcr扩增反应条件

扩增基因反应体系cdna模板引物序列退火温度循环次数产物大小pparγ25μl2μl上游: 5′atgacagcgacttggcaata3′50°c40341bp下游: 5′gcaactggaagaagggaaat3′βactin25μl1.5μl上游: 5′gtggggcgccccaggcacca3′55℃25500bp下游: 5′ctccttaatgtcacgcacgat3′

图1 pparγ蛋白在正常大肠粘膜(a)、大肠腺瘤(b)及大肠癌中的表达(c)

m:marker;control:阴性对照;n:正常大肠粘膜;a:大肠腺瘤;c:大肠癌表3 pparγ在正常大肠粘膜、大肠腺瘤

  3 讨论

pparγ是由配体激活的核转录因子ppars的一个亚型,亚油酸、花生四烯酸,15脱氧-△12,14-前列腺素j2(15d-pgj2) 是其天然配体,噻唑烷二酮类药物(tzd)、某些非甾体类抗炎药(nsaids),如舒林酸为其合成配体。pparγ的生物学功能复杂,在调控脂肪和糖代谢、脂肪细胞及单核细胞分化成熟、炎症反应、诱导肠细胞分化及肿瘤细胞的分化和凋亡中起重要作用。

已证实,pparγ在脂肪细胞中高表达,近期数据表明大肠中pparγ的表达水平与脂肪细胞中相似[1,2]。mansen[1]等免疫组化及western实验发现鼠大肠和小肠粘膜均表达pparγ。而且,pparγ在朝向管腔分化好的大肠粘膜细胞中表达水平较高,大肠中pparγ mrna的表达也高于小肠。lefebvre[3]等的研究发现啮齿动物和人类大肠中pparγ mrna及蛋白的表达水平高于小肠,而且pparγ都分布在分化较好的大肠粘膜细胞中。在 caco2和ht29人大肠腺癌细胞系中,pparγ的表达随分化级别的增高而增加,说明pparγ表达水平与大肠上皮细胞的分化表型有关。此外,在多种小肠肿瘤的小鼠中,pparγ在大肠中的表达也高于小肠[4,5]。这些结果表明肠道粘膜中存在pparγ,但它同大肠肿瘤的关系尚不明了。

最近的研究显示,pparγ的代表性配体-噻唑烷二酮具有抑制pparγ阳性的大肠癌细胞系ht29的生长和转移的作用[6]。而且,pparγ的配体可以促进多种细胞,包括大肠癌细胞的凋亡,并促进其分化及生长抑制[7]。可见,pparγ与大肠肿瘤的关系密切。

我们的研究显示:pparγ主要在朝向大肠管腔的分化好上皮细胞中表达,同国外的研究结果相同[1,3]。pparγ蛋白及mrna在正常大肠粘膜与大肠腺瘤无明显差别。然而,pparγ蛋白在大肠腺瘤中弥漫分布,可见于腺窝底部分化不好的上皮细胞中。同时,pparγ蛋白及mrna在大肠癌中高表达,明显高于正常大肠粘膜及大肠腺瘤中的表达。这些数据表明pparγ表达异常可能是大肠癌发生的早期事件,首先发生pparγ表达部位的异常,随后出现表达量的异常。我们研究显示重度异型增生腺瘤中pparγ mrna表达接近于大肠癌中的表达也支持这一假设。我们的结果同houseknecht[7]、dubois[8]和su[9]的结果一致。

然而,大肠肿瘤中pparγ升高的原因尚不明确。chen[10]等考虑大肠肿瘤中pparγ的高水平表达为代偿性的。已证实大肠癌中抗凋亡基因bcl2的表达升高,使大肠癌细胞凋亡减少而起到促进肿瘤生长的作用。同时,越来越多的证据说明激活pparγ后促进癌细胞的凋亡[1113],即pparγ和bcl2在大肠癌中的作用相反,两者在维持细胞的增殖、分化和凋亡的平衡中存在相互制约的关系。chen的研究[11]提示大肠肿瘤中pparγ内源性配体存在缺陷,在无外源性配体存在的情况下,pparγ不能被充分激活。大肠肿瘤中高表达的pparγ不能充分发挥其促凋亡作用,而高水平表达的bcl2却可以抑制大肠肿瘤的凋亡,为了与升高的bcl2维持制约平衡,大肠肿瘤中pparγ进一步代偿性升高。另外,park等[14]认为,在腺瘤样大肠息肉易感基因(apc)突变的大肠癌细胞中,ppars的另一个亚型——pparβ的表达也增加,而pparβ和pparγ竞争性结合维甲酸x受体(rxr)进而发挥其转录作用。因此,为了充分发挥作用,大肠癌细胞中pparγ水平升高。

总之,pparγ表达部位的变化首先见于大肠腺瘤,重度异型增生的腺瘤及大肠癌中pparγ的表达水平较高。这些数据表明pparγ可能在大肠癌发生的早期起作用,pparγ表达水平的升高有可能成为大肠肿瘤的表型标志。

参考文献
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