NADPH是最常见的辅酶，其在体外的再生可以通过以单个酶催化底物供氢体或级联多个酶来进行反应[25].单酶构建的NADPH再生模块已被广泛用于合成各种化合物。3种代表性的单酶构建的NADPH再生模块是醇/醇脱氢酶、甲酸/甲酸脱氢酶和葡萄糖/葡萄糖脱氢酶[26,27].以1个多酶催化体系中辅酶再生模块的构建为例，1个由12个酶组成的体外多酶催化体系，以纤维二糖为底物生成1个单位的葡萄糖可以产生12单位的NADPH[28].在所有的供氢体化合物中，成本最低的是糖类，但以它们为底物构建辅酶再生模块需要添加较多的酶，增加了系统的复杂性。利用电化学反应进行辅酶再生成本较低且相对清洁无污染，但NADPH在高电位时稳定性很差，如果想在工业上应用这项技术，必须解决现存的问题。

　　ATP是所有生物体的通用能量。与宿主细胞内可以不断合成ATP不同，在体外多酶催化体系中，如果某些反应需要ATP参与，需要设计ATP再生模块，低成本ATP再生是其面临的一个最关键的障碍。

　　体外ATP再生的方法包括底物水平磷酸化、NADPH的氧化磷酸化和光诱导ATP合成[29,30].

　　目前应用最广泛的体外ATP再生技术是底物水平磷酸化，常见的磷酰基供体包括乙酰磷酸、磷酸二羟丙酮和磷酸肌酸等。这些磷酸盐的利用会导致磷酸根的积累，从而改变pH,抑制体系中的酶活。此外，过高的底物成本也导致其不能应用于大规模生产。

　　使用非磷酸盐的化合物可避免磷酸根积累的问题。

　　通过利用糖酵解途径中的反应，葡萄糖和丙酮酸盐已作为底物用于无细胞体系中ATP的合成。最近，由麦芽糖糊精磷酸化酶介导的反应以麦芽糖糊精作为底物生成ATP,与葡萄糖相比，每单位麦芽糖糊精可以多生成1个ATP,同时生成可以缓慢释放能量的化合物葡萄糖-6-磷酸，更可能应用于大规模生产[31].

　　4多酶催化体系的应用

　　无细胞多酶催化体系的应用最初可以追溯到100多年前。1897年，EduardBuchner使用酵母提取物将糖转化成乙醇和二氧化碳，凭借这一成就，他获得了1907年的诺贝尔化学奖。从那时起，无细胞多酶催化体系逐渐为人们所熟知并加以应用。无细胞多酶催化体系的构建不仅能在一定程度上克服体内代谢途径的缺点，还拥有产量高、纯度高以及反应速度快等优点，目前已经成为合成高价值化合物和生物能源的一种新选择[32].

　　4.1生物制氢

　　无细胞合成体系最初在生物产氢研究领域取得了较大的突破。美国橡树岭国家实验室的Woodward等[33]利用葡萄糖-6-磷酸作为反应底物，在体外成功构建了1条生物产氢的催化途径，最终每摩尔葡萄糖-6-磷酸经过一系列反应得到了11.6摩尔氢气。然而，葡萄糖-6-磷酸作为反应底物存在几个缺点：成本偏高;游离的磷酸作为最终产物会结合Mg2+,从而影响参与反应的部分酶的活力;磷酸积累造成pH波动过大，不利于体系的平衡[34].弗吉尼亚理工大学的Zhang课题组[31]为了解决这些问题，将葡聚糖作为反应起始底物，利用低聚的糖苷键和多糖的化学键能量，通过添加少量可回收利用的磷酸根离子和适当的磷酸化酶，在原有途径基础上引入了从葡聚糖到葡萄糖-6-磷酸的两步反应，取得显着效果，氢气产量提高到12mol/mol(底物)，且不需添加ATP.由于葡聚糖价格更低(约0.15$/kg)、更易获得，因此新途径能有效降低生产成本(图2)。2013年，Zhang课题组[35]在体外构建了利用木糖产氢气的无细胞合成体系(图3)。可以预见，通过使用更为廉价的底物可以进一步降低成本，为生物产氢工业化奠定基础。

　　4.2生物食品和生物燃料

　　纤维素是地球上含量最丰富的有机化合物之一，并且是可再生能源的一种理想原材料来源。如今，它还能够解决人类的温饱问题。在一项新的研究中，Zhang课题组[36]找到了一种将纤维素转化为淀粉的新途径。为了实现这种转化，他们选择了植物、真菌和细菌来源的内切葡聚糖酶-纤维二糖水解酶、纤维二糖磷酸化酶和a-葡聚糖磷酸化酶，通过基因设计与优化，人工合成具有大肠杆菌密码子偏好性的基因序列，在大肠杆菌中表达，最终得到了需要的酶，并在体外构建了多酶催化体系(图4)。与将纤维素完全分解为葡萄糖，再重新将其组装为淀粉不同，他们首先将纤维素分解为纤维二糖，随后将纤维二糖分解为葡萄糖及G-1-P,G-1-P起到构建直链淀粉模块的作用。通过这种体外多酶催化体系，他们可将高达30%的纤维素转化为淀粉，剩下的纤维素水解为葡萄糖，通过酵母的转化在同一生物反应器中生产乙醇。