底物通道效应(substratechanneling)指在多酶催化的代谢途径中前一个酶所催化产生的产物直接进入下一个酶的活性中心，而不是扩散进入所在的反应体系环境中[11].在传统的生物催化级联过程中，所有的酶均匀分布在反应器中，存在酶稳定性差、产物分离复杂、酶难以回收、环境耐受性差以及中间传递效率等诸多问题，因此，需要发展有效的固定化酶策略来实现多酶催化的底物通道效应，同时可以保持酶的活力稳定性及重复使用性。

　　多酶催化体系的固定化是酶工程领域的前沿课题之一，探索和研究新的固定化技术，开发适用范围广、可应用于多酶催化的固定化酶载体材料，为多酶体系创造适宜的微环境是这一领域的基础性研究。

　　当前多酶催化体系的固定化主要有以下方式：简单的多酶融合、使用支架系统进行共固定化、简单的共固定化及位置组装的共固定化等(图1)[12~16].多酶催化体系的固定化效果与载体的选择有很大关系，载体材料的结构和性质对固定化酶的活性有很大影响[17].随着固定化技术的发展，载体材料由最初的天然高分子材料，扩展到合成高分子材料、无机材料及现在备受关注的复合材料。复合载体材料综合利用高分子材料和无机材料优点，与其他载体材料相比，具有特殊功能的复合材料有巨大优势，因此复合材料是固定化载体材料发展的必然趋势[18,19].

　　基因工程领域的最新研究进展表明，生物偶合可以提供相应的工具以更加可控的方式构建多酶催化体系，通过人工合成的结合域，可以将参与反应的多个酶共同固定于支架体系，如RNA支架系统、DNA支架系统、合成蛋白支架系统、自组装蛋白支架体系等。在利用RNA分子作为支架系统方面，Delebecque等[20]利用RNA分子适配体将产氢需要的2种酶进行了空间组装，利用RNA分子的折叠形成一维或者二维的脚手架结构从而实现酶分子的空间构建，其中二维结构的RNA脚手架结构使氢的产量提高了48倍。在利用DNA分子作为支架系统方面，Wilner等[21]以DNA分子作为脚手架形成六角形结构，将葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)2个酶进行固定化，将酶分子聚集后反应速率大幅度提高。在利用蛋白质作为支架体系方面，不仅可以利用自然界存在的蛋白作为支架，也可以人工构建新的蛋白支架体系。细菌纤维小体是多种纤维素酶、半纤维素酶依靠锚定-黏附机制所形成的一种多酶体系，通过细胞黏附蛋白附着在细菌的细胞壁上。近年来，通过模仿自然界中纤维小体的.构造人工合成纤维小体得到了广泛研究，Tan课题组[22]利用来自Clostri-diumcellulovorans,C.cellulolyticum,C.thermocellum的锚定结构域和黏附结构域构建了人工纤维小体，通过黏附-锚定机制将降解纤维素的酶固定到酿酒酵母细胞壁的表面，将纤维素降解后在酵母体内进一步转化生成生物乙醇。利用这种方法，乙醇的产量最高达到1.4g/L.另外，利用蛋白质的自组装进行多酶体系的构建也具有广阔的应用前景，借助蛋白质的自组装完成多酶体系的构建只需要将蛋白质或者酶分子进行简单的混合而不需要进行特殊处理。Dueber等[23]利用信号转导过程相关蛋白的一部分作为蛋白支架体系构建脚手架，3个支架蛋白包括GTP酶结合结构域(GBD)、SH3结构域(SH3)和PDZ结构域(PDZ)。

　　通过将催化乙酰CoA到甲羟戊酸的3个酶-乙酰CoA硫解酶(AtoB)、HMG-CoA合成酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR)分别与GBD,SH3,PDZ的配基相连，利用配基与蛋白支架之间的特异性相互作用从而将3种酶分子组成多酶复合体，通过进一步优化支架体系，调节不同支架蛋白的比例，甲羟戊酸的产量最高提高了77倍。

　　3.2生物积块(buildingblocks)与模块(modules)的构建

　　无细胞的合成生物技术采用自下而上的设计策略，包括生物积块的构建(单独的酶)、几种酶组合成的功能模块的构建(产物生成模块、辅酶再生模块、ATP合成模块)和复杂代谢途径的组装及应用(以糖为底物生产氢气等)。体内代谢途径的标准生物组件是对应的DNA序列，体外代谢途径的标准生物组件则是各种酶。通过将多个酶组合成功能模块，再将不同的功能模块进行组装，可以实现体外代谢途径的构建。

　　酶催化的生物转化反应中，约30%是氧化还原反应，这些反应需要辅酶/辅因子的参与，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD(P)H)或黄素腺嘌呤二核甘酸(FAD)。宿主细胞可以通过合成代谢和分解代谢的平衡来调节辅酶/辅因子的量，体外多酶催化体系则需要不断补充辅酶/辅因子。在体外构建多酶催化体系，底物的成本需要远低于产物的价值，因此，通过组合积块构建廉价的辅酶再生模块显得尤为重要[24].