RPHPLC法测定阿魏酸衍生物的含量测定的方法论文

　　阿魏酸衍生物(BL)是对阿魏酸(Ferulic Acid，4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)苯环进行改造后的化合物，是一个良好的抗氧化剂[1]。文献[2]报道其清除自由基的能力比阿魏酸明显增强。BL结构中溴原子的引入[2]，不仅提高了清除自由基的能力，还明显增大了脂溶性，这有利于其在生物体内的转运与吸收。本文参照文献[3-6]建立了反相高效液相色谱方法，用于测定BL含量及其有关物质，为其质量的可控奠定基础。

1 仪器与试剂

　　Waters 600-717-996高效液相色谱仪(二元泵，二极管阵列检测器，自动进样器，Millennium32色谱工作站);电子分析天平(Sartorius，BP211D);KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);甲醇(色谱纯，禹王试剂);乙酸(分析纯，国药集团);水(娃哈哈纯净水);30%H2O2(分析纯，国药集团);盐酸(分析纯，国药集团);氢氧化钠(纯度：96.0%，西陇化工有限公司);BL对照品(批号：20121101纯度：99.91%，由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供);BL供试品(由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供，批号分别为20130201，20130202，20130203)。

2 色谱条件与系统适用性试验

　　采用Agilent Eclipse C18(250mm×4.6mm，5?m)色谱柱;流动相：甲醇-0.1%乙酸(42：58，V/V);紫外检测器检测波长228nm;流速1.0mL·min-1;进样量20?L;柱温：40℃。理论塔板数以BL计算不低于5000，分离度大于1.5，色谱图见图1(主峰保留时间：14.5min，杂质1保留时间：5.8min，杂质2保留时间：12.8min，杂质3保留时间：38.8min)。

3 溶液的配制

　　3.1 对照品溶液

　　取BL对照品约10mg，精密称定，置50mL棕色量瓶中，加适量甲醇超声助溶，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

　　3.2 供试品溶液

　　取BL供试品约10mg，精密称定，置50mL棕色量瓶中，加适量甲醇超声助溶，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

4 方法专属性考察

　　分别精密称取BL供试品约20mg，置3个25mL棕色量瓶中，加甲醇适量，超声助溶，进行如下破坏试验：①酸破坏：加1mol·L-1盐酸1mL，室温下静置17h，用1mol·L-1氢氧化钠中和，加甲醇稀释至刻度，摇匀;②碱破坏：加1mol·L-1氢氧化钠4mL，室温下静置65h，85℃水浴2.5h，冷却至室温，用1mol·L-1盐酸中和，加甲醇稀释至刻度，摇匀;③氧化破坏：加30%双氧水8mL，室温下静置62h，85℃水浴2.5h，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

　　按照“2”项下的'色谱条件，分别取各破坏溶液20?L进样，记录色谱图，见图2。 通过破坏试验可以看出BL 在碱、氧化条件下比较稳定，放置期间有关物质略有增加，在酸性条件下极不稳定，有关物质增加明显，但有关物质均与主峰分离良好，不干扰样品测定，说明该方法专属性好。

5 方法学考察

　　5.1 线性关系考察

　　精密称取BL对照品(批号：20121101)约4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg、16mg分别置于50mL棕色量瓶中，加适量甲醇超声助溶并稀释成约0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL、0.28mg/mL、0.32mg/mL的梯度对照品溶液。分别取上述溶液20?L进样测定，记录色谱图。以峰面积A对浓度C(mg·mL-1)进行线性回归，得回归方程 A=84486C-327332(r = 0.9996)，表明BL在0.08～0.32mg·mL-1浓度范围内呈良好线性关系。

　　5.2 仪器精密度试验

　　取浓度为0.20mg/mL对照品溶液，连续进样6次，每次20?L，以峰面积计算，所得RSD为0.57%(n=6)，表明测定时的仪器精密度良好。

　　5.3 重复性试验

　　取同一批号的BL供试品按“3.2”项下方法操作，配制成0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL的低、中、高3个浓度的标准溶液，每个浓度平行配制3份，共9份，照“2”项下色谱条件测定，按外标法以峰面积计算样品含量，测得平均含量为100.35%，RSD为0.50%(n=9)，表明方法重复性良好。

　　5.4 稳定性试验

　　取室温下放置的低、中、高3个浓度的供试品溶液，各取20?L在0，4，6，8，10，12h的条件下，按照“2”项下色谱条件测定峰面积，测得RSD分别为1.7%、1.4%、1.3%，表明供试品溶液在12h内稳定。