3.3 NaN3 抑制条件下，菌种运输富集正十六烷的规律

　　王红旗[19]等人的研究表明加入正十六烷进入30 mmol·L-1 的NaN3 可使正十六烷在菌体内的富集量均减少80%以上，因此微生物运输烷烃是需要能量的。这部分实验选用能阻止细胞氧化磷酸化的NaN3 为抑制剂从而阻止ATP(三磷酸腺苷)的生成，如果加入合适浓度的NaN3 后菌种体内富集的正十六烷减少，则说明该菌种运输正十六烷的方式是需要能量的，相反，如果加入的NaN3 并未影响菌种体内富集正十六烷，则说明这个过程是不需要能量的被动运输过程。为进一步研究NaN3 抑制条件下不同时间内菌种主动运输富集正十六烷的情况，分别在1min，4min，5min，8min，10min，14min，18min，25min 等一系列时间内测定菌和上清液中正十六烷的浓度变化(其中8.5min 后加入30 mmol·L-1 的NaN3)，以过程中不加入NaN3 后测定的菌体内正十六烷浓度为对照。

　　如图3a 和图3b 所示，在8.5min 加入NaN3 之前，2 菌株体内运输富集的正十六烷浓度略有增高，培养液中的正十六烷浓度基本不变，之后随着抑制剂NaN3 的加入，2 菌株体内富集的正十六烷明显下降，相应上清液中的正十六烷浓度则明显增加。以DQ01 为例，在加入NaN3 时，细胞膜内正十六烷含量为3.12 mg·L-1，而在加入NaN3 的第10min,细菌体内正十六烷含量迅速降为1.54 mg·L-1，而对照组中细胞内正十六烷含量为3.17 mg·L-1，上清液中的正十六烷含量也由加入NaN3 前的16.54 mg·L-1 增加到18.52mg·L-1。结果表明，NaN3 抑制了DQ01 对正十六烷的主动运输。发生这种变化的原因为，微生物细胞内，烃类物质的主动运输和生物降解是同时发生的，但当主动运输受阻时，进入到细胞内的底物减少，但存在于细胞内的烃被不断生物降解，因此，加入NaN3 后，菌株体内富集的烃含量降低，细胞外又有烷烃不断憎溶到水相中，因此上清液中烷烃含量会有所增加。相似的结果也在其它文献中有报道。Aristeides K[20]的研究表明在培养液中加入能阻止ATP 生成的叠氮化钠和2，4-二硝基苯酚都能使Arthrobacter sp. strain Sphe3 体内富集的菲含量。Whitman[21]等人发现P.

　　fluorescens 通过与能量有关的特殊运输系统降萘摄入体内。只有经过引诱处理的降解菌Mycobacterium sp. strain RJGII-135 才能通过主动运输方式摄取菲[22]。

　　3.4 细胞膜内包涵体的观察

　　石油类物质作为基质通常需要由特定的、诱导性的运输系统吸收到细胞内，这对石油的微生物降解尤其重要。那么，进入微生物体内的正十六烷又是以何种状态存在的还需要进一步试验分析。Kennedy[23]研究发现细菌Acinetobacter sp.在以正十六烷和正十七烷为唯一碳源时，体内均会出现明显的包涵体，而在以非烃类化合物为碳源时，细菌体内没有出现包涵体。

　　本次实验用TEM 对2 株菌体内的包涵体进行了观察，结果如图4 和图6 所示，以正十六烷为唯一碳源时，蜡状芽孢杆菌DQ01 和芽孢杆菌DQ02 的菌种体内均出现了包涵体，但2 株菌中包涵体的形态不同差异，如图4 所示，DQ01 体内的包涵体数目较多，呈透明、光滑的球状，而DQ02 的包涵体不规则，并分散在菌种体内(如图6)。而在以葡萄糖为唯一碳源时，2 株菌体内没有发现包涵体(如图5 和图7)，说明这些包涵体完全只与烃类的代谢有关，微生物通过未修饰烷烃的运输作用把烷烃转移到细胞内的烷烃氧化部位，所以出现了包涵体，这些包涵体的主要成分可能是中性脂质和未改变的正十六烷，并且由含有多种蛋白质的单分子层磷脂薄膜包围[24-25]。但具体成分需要GC-MS 进一步分析。

　　Hector[26]等人发现在不同碳源培养基中，细菌Rhodococcus opacus strain PD630 体内会出现球状和不规则状包涵体，其形状的不同与组成包涵体的脂类和亲脂性化合物不同有关。

　　当Rhodococcus opacus strain PD630 以正构烷烃为基质时，其体内包涵体中的主要脂类物质为与基质含有相同碳原子数的烷链酸以及烷链酸;在以葡萄糖酸、乙酸和果糖为基质时，Rhodococcus opacus strain PD630 包涵体中的脂类物质主要是十六酸;而在以丙酸为基质时，组成包涵体的物质主要为奇数碳原子数的烷链烃，如十五烷和十七烷等。因此，需对DQ01和DQ02 体内包涵体中的组分进一步定性分析，从而揭示2 菌株对烷烃的富集机制。

　　4 结论

　　(1)微生物细胞内能富集正十六烷，且富集量随时间有逐渐增大趋势。不同浓度的正十六烷导致2 株菌对正十六烷的运输富集量不同，在实验范围内，正十六烷的浓度增大可以加大2 株菌对正十六烷的运输富集，但到一定浓度，细胞体内富集的正十六烷的量趋于稳定。