2.2.4 超薄切片的制备和微生物体内包涵体的观察

　　参考 Preusting H [12]所用方法：将生长48h 的微生物离心后，倒去上清，2.5%戊二醛固定4h，PBS 缓冲液冲洗3 次，1%锇酸固定2h，PBS 缓冲液冲洗3 次。然后分别用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇脱水，每次15min。将环氧丙烷与EPON812 树脂按3?1 比例混合，放入样品，静置60min。将环氧丙烷与EPON812 树脂按1?1 比例混合，放入样品，静置60min。将环氧丙烷与EPON812 树脂按1?3 比例混合，放入样品，静置60min。将样品放入EPON812 树脂，静置60min。将样品用EPON812 树脂包埋剂进行包埋，60℃下放置24h。将聚合好的包埋块修块、超薄切片，然后醋酸双氧铀染色30min，柠檬酸铅染色30min，最后进行电镜观察。对电镜内细胞中包涵体物的情况进行分析。对照是用葡萄糖培养基培养的2 种菌种在培养48h 后用上面的步骤处理。

　　2.2.5 GC 条件

　　采用 Varian3800 气相色谱仪，色谱柱为HP-SE-54(30m，0.25mmid),载气(N2)流速为16-20cm/s，进样口分流比为60?1，进样口温度为250℃，FID 检测器温度为300℃，柱温100℃保持2min，并以10℃/min 升温到250℃保留10min。

　　3 结果与讨论

　　3.1 不同正十六烷浓度对菌种运输富集的影响

　　从图可看出，蜡状芽孢杆菌DQ01 和芽孢杆菌DQ02 体内富集正十六烷的含量随初始培养液中正十六烷浓度的增加而增加，且在各个浓度水平上，DQ01 细胞内富集的正十六烷量高于DQ02 体内正十六烷的富集量，说明在实验浓度范围内，2 菌株细胞外正十六烷浓度的增大可以加大2 株菌对正十六烷的运输富集。如当培养液中正十六烷初始浓度为20 mg·L-1时，20min 后，进入DQ01 细胞内的正十六烷浓度为2.76 mg·L-1，而当培养液中正十六烷初始浓度为40 mg·L-1 时，进入DQ01 细胞质中的正十六烷浓度为5.22 mg·L-1。原因为，正十六烷的浓度增大，加大了微生物对有机底物的接触几率，从而增加了进入细胞内的有机物的含量。但随着初始正十六烷浓度的增加，细胞质中富集的正十六烷含量趋于稳定，如正十六烷初始浓度分别大于50 mg·L-1 和30 mg·L-1 时，DQ01 和DQ02 细胞内富集的正十六烷增加缓慢，可见，正十六烷降解菌细胞膜内富集底物的能力与有机底物的初始浓度有关，这一现象与Kappeli.O 研究结果一致[13]。随着培养液中正十六烷含量的增加，微生物DQ01 和DQ02并没有表现出中毒性状，2 株菌体内富集的烷烃量反而增加，这是因为微生物通过调节细胞膜的流动性和细胞膜中不同脂肪酸含量比例来适应毒性逐渐增加的环境，并发挥对有机底物的降解功能[14]。随着培养液中烷烃含量的增加，细胞膜中顺式和反式不饱和脂肪酸的比例降低，不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比例的增加都能增大细胞膜的流动性，从而弥补了有机物对微生物产生的毒性效应[15-16]，因此仍需深入分析DQ01 和DQ02 细胞膜中以及膜内不同脂肪酸的组成比例，从而更好地掌握微生物对烷烃的运输机制。

　　3.2 菌种运输富集正十六烷的机理分析

　　微生物能降解去除环境中的有害有机物，但对于微生物如何将这些有机物质运输到体内，人们的认识还很有限。被动转运是物质顺浓度梯度进行的跨膜转运方式，此过程不需消耗细胞本身代谢能，穿膜动力来自物质自身的热运动或浓度差。主动转运是通过消耗细胞自身代谢能进行的跨膜转运，需要膜上专一性载体,其转运速度一般比被动转运要快很多，可以逆浓度梯度运输，从而使生活在低基质环境中的微生物获得营养[17]。

　　这部分实验从细胞内外浓度差方面分析正十六烷的跨膜运输方式。从图2 可以看出，当培养液中正十六烷初始浓度为20 mg·L-1 时，在实验阶段吸附在DQ01 细胞表面的正十六烷浓度均小于被菌种运输富集到体内的正十六烷浓度，如在第0-10min 这个时间段里，DQ01细胞表面吸附的烷烃量呈增大趋势，并在第10min 达到吸附最大值1.10 mg·L-1，而DQ01 细胞内富集的烃浓度为2.72 mg·L-1，之后，细胞膜上吸附的烷烃量趋于稳定，整个实验阶段，DQ01 以逆浓度梯度方式将正十六烷运输到细菌体内。DQ02 运输正十六烷的方式与DQ01不同，在实验前10min，DQ02 细胞膜上吸附的正十六烷含量高于细胞内富集的烃含量，并在第10min 二者含量相同，均为2.01 mg·L-1，此后，DQ02 吸附的烷烃量开始下降，并低于细胞内富集的烷烃量。20min 后，DQ02 细胞膜上和体内富集的正十六烷含量趋于稳定，因此DQ02 首先以顺浓度梯度方式运输烷烃，之后，以逆浓度梯度方式将烷烃运输到菌种体内，即DQ02 先后通过被动扩散和主动运输运过程将烷烃运输到2 菌株体内。此外，DQ01 细胞膜上的烃含量明显低于DQ02 细胞吸附的烃，分析其原因可能与降解菌膜内，膜周和胞外酶的降解能力不同有关[18]。蜡状芽孢杆菌DQ01 的降解酶主要定域于膜周和膜内，且膜内酶的降解能力高于膜周酶，这种差别促使更多的十六烷以逆浓度梯度方式运输到细胞内被降解;芽孢杆菌DQ02 的降解酶主要定域于胞外和膜内，且降解能力相同，所以细胞膜内外的烃浓度差不明显。