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关于体外肝代谢系统的研究与应用探讨(第2页)

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关于体外肝代谢系统的研究与应用探讨(第2页)

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  1.2.4考察手性药物的代谢立体选择性

  周权等[9]把手性药物与大鼠肝微粒体相结合,对其立体选择性代谢作了详细的考察。作者把R/S?普罗帕酮(propafenone,PPF)加入经地*米松或β?萘黄酮诱导的大鼠肝微粒体中孵育,经提取及手性拆分后,进入HPLC系统分析。结果显示,与对照组相比,在经诱导的肝微粒体中,PPF的Ⅰ相代谢呈显著的立体选择性。

  总之,改进后的体外肝微粒体法耗时少,重现性好,易大量操作。适用于酶活性及体外代谢清除等方面的研究,在实际工作中应用较广。但同其他体外肝代谢方法相比,需要的原材料较多,且与体内情况的一致性方面存在不足,因而其结果是否有利预测体内情况仍需进一步研究。

  2基因重组人肝微粒体CYP450酶系

  利用基因工程及细胞工程,将调控CYP450酶系表达的基因整合到大肠杆菌或昆虫细胞,再经培养可表达高水平的CYP450酶系,纯化后还可获得较单一的CYP450同工酶。在明确某些药物经特定酶代谢后,即以此酶进行单一代谢,更准确地观察代谢结果,避免受其他酶共同参与此代谢途径的干扰。Ching等[10]通过在酵母中克隆方法,得到高表达的人CYP 1A1和CYP 1A2,用于测定普萘*尔对映体的去烃基化和环羟化反应的立体选择性和酶动力学参数,明确了CYP 1A2均参与了2种途径,但CYP 1A1只参与了去烃化反应。有学者进一步运用重组人肝微粒体,应用酶抑制剂对普萘*尔对映体的代谢途径进行对照实验[11-13]。其中Yoshimoto等[12] 应用基因重组的及人肝微粒体中的CYP酶系同工酶进行研究,发现α?萘黄酮对普萘*尔R/S对映体的N?脱异丙基化(desisopropylation)抑制作用分别为20%和40%;奎尼丁对其2种对映体的4?环羟化代谢的抑制作用较完全;而其他酶抑制剂对其对映体的影响较小。

  基因重组CYP450酶系与前述的肝微粒体在研究药物代谢方面具有一定的相关性。但前者在药酶诱导特异性和选择性研究上优于其他的体外方法,并可在分子水平上,为药物与酶在结合位点的相互作用研究提供更多的信息。尽管该方法先进性较为突出,但由于受到设备条件和技术的限制,通过基因工程获得的酶量与种类仍较有限,纯化程度有待进一步提高,故其作为研究代谢的体外系统的地位仍有待进一步提高。

  3肝细胞培养

  3.1体外培养技术与细胞活性的维持

  体外培养包括肝细胞株的培养和原代肝细胞的分离与培养。根据细胞来源于不同,经重复筛选可制备出不同型号的肝细胞株,满足各种实验需要。肝细胞株容易贴壁存活,在相对稳定的培养条件下,传20~30代不会出现明显衰老现象。原代细胞需经过从器官中分离的过程,存在分离难度大、体外培养要求条件高、存活时间短、增殖及传代困难等问题。多数研究者采用改良的Seglen两步胶原酶灌注法。但此法操作繁琐,设备及实验技术要求高,影响因素较多[14],包括灌注液的种类和速度、肝脏灌洗是否充分、分离消化的酶、培养液的组成和肝细胞悬液的离心清洗等。鉴于上述原因,刘友平[15]等采用肝组织块贴壁法原代培养,即只把组织块剪碎,不用胶原酶消化,直接按肝细胞的培养方法进行贴壁培养,在传代时加胰酶消化,只取上层细胞悬液继续培养。该法简单快捷,无需灌注、离心,所得肝细胞活力高。

  为了解决肝细胞活性体外维持时间短的问题, Hengstler[16]等研究优化肝细胞冷冻技术。同新鲜肝细胞相比,经过该技术冷冻储藏的肝细胞活性为新鲜肝细胞的80%以上,而其Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶的活性>60%,可用于反应时间不超过8h的代谢研究,亦可用于药酶的诱导研究,但该技术仍需进一步优化。

  3.2肝细胞培养的主要应用

  3.2.1进行药物体外代谢途径与体内相关性研究

  Nakagawa等[17] 将BPA[2,2?bis(4?hydroxyphenyl)propane,2,2?双(4?羟苯基)丙烷]加于大鼠肝细胞中,经质谱检测,BPA很快代谢为单葡萄糖醛酸结合物及2个次要代谢物(单硫酸结合物和3?OH?BPA)。在BPA体内代谢研究中发现,约20%~30%的BPA从尿中排泄,主要为首过效应中生成的葡萄糖醛酸结合物,其中硫酸结合物占尿液中总代谢物的2%~3%[18]。因此BPA肝细胞体外温孵与体内过程很相似,具有一定的代表性。

  3.2.2进行药物体外代谢清除研究

  Shibata[19]等人运用冷藏保存的人肝细胞混悬于100%的人血浆中,将预测的肝利用度及清除率与14种临床常用的药物的生物利用度和血浆清除率进行比较时,发现不同的细胞来源,内在清除率存在极大的个体差异性。同时在基础的生物定标系数(3.1×109 个/kg)下,用外推法将体外实验结果应用于体内实验的预测,往往会出现明显的偏低现象,因此计算的定标系数应比基础生物大3~5倍。为获得更可靠的定量预测结果,通过预试验来确定校正的定标系数是至关重要的环节。

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