2材料与方法

　　2.1材料与仪器、试剂

　　本研究于2011年7月，完成了湖南、湖北、四川、贵州四省11个代表性天然琪桐种群的样品采集(见表1)。每个种群采集20株以上的个体，为了防止采集到同一个母株后代的植物，保持单株之间距离50m以上，共采集240株个体。采样遵循以下原则(1)全部选取野生的自然种群;(2)样品具有代表性，尽可能的覆盖其分布的地理区域。野外采集的琪桐新鲜嫩叶立即放入装有桂胶的密封袋中，记录各种群的地理位置及个体数。带回实验室后，将叶片放入-7(rc的冰箱中保存备用，并制作种群凭证标本。标本保存于中南林业科技大学林木遗传育种实验室。

　　3 结果与分析......................... 33-48

　　3.1 珙桐基因组DNA的提取和检测......................... 33-34

　　3.1.1 珙桐基因组DNA的电泳检测......................... 33

　　3.1.2 珙桐基因组DNA的核酸蛋白分析检测......................... 33-34

　　3.2 珙桐ISSR分子标记结果与分析 .........................34-44

　　3.2.1 ISSR部分引物的初筛及退火温度的确定......................... 34

　　3.2.2 ISSR反应体系的单因素优化......................... 34-38

　　3.2.3 ISSR反应体系的正交设计优化 .........................38

　　3.2.4 ISSR最佳反应体系及程序确定............

　　............ 38

　　3.2.5 珙桐ISSR引物筛选与退火温度确定 .........................38-41

　　3.2.6 珙桐遗传多样性的ISSR分析 .........................41-44

　　3.2.6.1 ISSR-PCR扩增片段多态性......................... 41

　　3.2.6.2 种群多态性......................... 41-42

　　3.2.6.3 种群遗传分化......................... 42-44

　　3.3 珙桐cpDNA非编码序列标记结果与分析......................... 44-48

　　3.3.5 单倍型的系统发育分析 .........................47-48

　　4 结论与讨论......................... 48-52

　　4.1 珙桐ISSR种群遗传多样性结论与讨论 .........................48-49

　　4.1.1 珙桐种群遗传多样性......................... 48

　　4.1.2 珙桐种群遗传结构......................... 48-49

　　4.2 珙桐cpDNA非编码序列结论与讨论......................... 49-51

　　4.3 珙桐遗传资源保护......................... 51-52

　　结论

　　基于珙桐的ISSR分子标记和叶绿体DNA非编码序列标记研究，通过分析拱桐的遗传多样性和分子谱系地学，为琪桐的遗传资源保护提供了一定的信息。遗传多样性是物种适应外界环境变化的进化潜力基础，遗传多样性丢失将大大降低个体的适应度和物种应对环境变化的适应能力。琪桐物种和种群维持较高水平遗传多样性，种群间产生较大遗传分化，表明种群内个体间杂交不可能导致近亲衰退，物种具有较大的进化潜力。

　　据此，建议尽可能地保护琪桐所有的天然种群原生境条件，禁止滥砍滥挖，以保护尽可能多的遗传变异。其中，优先保存四川峨眉山、湖南桑植和贵州梵净山等遗传多样性丰富度高的种群。由于珙桐天然更新困难，应积极开展琪桐天然林人为促进更新措施。琪桐为世界著名的观赏木本植物，种苗具有很高的商业价值，但其对生境要求严格，自行繁殖困难很大,引种人工林中开花结实植株不多。因此，应加强珙桐引种驯化和人工繁殖技术研究，这不仅能缓解琪桐天然种群由于自身繁殖能力不足以及人为采挖造成对其生存的威胁，而且可以确保异地引种人工林开花结实，可持续生存繁殖。