评价生物素营养的主要技术综述

生物素(biotin) 又称维生素H、维生素B7,是一种水溶性维生素,广泛分布于动植物组织。生物素作为哺乳动物体内5种羧化酶的辅酶,参与糖原异生、脂肪酸合成、氨基酸分解和能量的代谢[1-2].生物素可以通过参与组蛋白的生物素化,来参与染色质相关蛋白质及组蛋白修饰的下
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  摘要

生物素(biotin) 又称维生素H、维生素B7,是一种水溶性维生素,广泛分布于动植物组织。生物素作为哺乳动物体内5种羧化酶的辅酶,参与糖原异生、脂肪酸合成、氨基酸分解和能量的代谢[1-2].生物素可以通过参与组蛋白的生物素化,来参与染色质相关蛋白质及组蛋白修饰的下游事件[3-4],影响胰岛素分泌,导致糖尿病、免疫性疾病[5]的发生。
  
  哺乳动物肠道细菌可以产生生物素[6],人体一般不需从食物中额外补充,故生物素渐渐成为“被遗忘”的维生素。服用抗惊厥药物[7]、不当饮食习惯( 长期食用生鸡蛋清、吸烟、饮酒等) 致肠道菌群正常活动受损,或者先天性生物素相关酶的缺乏( 如羧化酶全酶合成酶,HCS) 可致生物素缺乏,主要表现为皮肤和神经系统症状,患者表现为不同程度的体重减轻、脱发、脂溢性皮炎、结膜炎等。多种动物实验结果表明生物素缺乏还有致畸[8-9]、致死作用。
  
  直到21世纪初美国MOCK等[10-12]通过测定孕期妇女血清生物素和尿中3-羟基异戊酸(3-hydroxyisovaleric acid,3HIA) 含量,指出尽管膳食摄入正常含量生物素,仍有近1 /2的孕妇出现生物素缺乏的现象。生物素再次引起人们的关注,并使得有关生物素生理状况的评价技术成为研究的热点。部分学者使用血尿中酰基肉碱含量[13]的变化来判断生物素营养状况。然而关于生物素营养状况指标测定方法较多,各方法之间的关联性、评价技术的敏感性和特异性以及各种指标正常范围值尚未有统一结论,因此本文对生物素营养状况评价技术的相关研究进展做一综述。
  
  1生物素在体内的代谢途径
  

  生物素通过与体内羧化酶上赖氨酸残基的ε-氨基基团共价结合形成羧化酶的辅酶,即丙酰辅酶A羧化酶(PCC)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(MCC) 和丙酮酸羧化酶(PC) ,参与体内氨基酸代谢、脂肪酸合成和糖代谢[1-2]过程。哺乳动物体内生物素通过参与羧化酶的正常代谢,转化为双降生物素、生物素硫氧化物以及生物素砜等[3].当羧化酶的活性下降时,生物素的代谢通路发生变化。ACC活性下降,丙二酰辅酶A活性改变,生成较多乙酰肉碱和丙酰肉碱。实验证明3HIA和3HIA-肉碱是亮氨酸代谢的产物,当3-甲基巴豆酰辅酶A活性下降时,MCC代谢途径变化,生成较多的3HIA和3HIA-肉碱。而3-甲基巴豆酰辅酶A的活性与生物素的水平密切相关,因此MOCK建议使用尿液中有机酸的含量来表示生物素的营养状况。
  
  2生物标志物的选择
  
  血清和尿液中生物素的浓度及其代谢产物可作为生物素营养状况的潜在标志物。研究表明,外周血淋巴细胞生物素依赖羧化酶活性可以较早反应人体生物素边缘性缺乏。同时最新研究表明羧化酶MCC活性下降可导致机体血浆和尿液中3HIA、3HIA-肉碱等有机酸含量增加,可作为评价早期生物素营养缺乏的敏感指标。
  
  3生物素营养状况评价方法
  

  3. 1微生物法
  
  微生物法一直是生物素分析的传统方法,其原理是在一定生长条件下,利用特殊细菌生长与生物素含量之间的线性关系测定血浆和尿液中总的生物素含量。微生物法灵敏性强,可以测定具有生物活性的生物素,但是无法区分生物素的衍生物及代谢形式,无法了解生物素代谢过程中的变化,容易低估生物素的生物利用率,且测定过程比较繁琐,测试周期长,结果重复性差,因此同次实验内结果比较尚可,但是不同实验间的横向比较结果差异较大,推广应用受限。
  
  3. 2酶联免疫吸附试验
  
  酶联免疫吸附试验(ELISA) ,利用生物素与链霉亲和素的强亲和力,通过特异性识别来检测生物 素 的 含 量,是 一 种 通 用 的 测 定 方 法。MISHRA等[14]采用生物素与链霉素亲和素标记的过氧化物酶的竞争反应,测定链霉素亲和素过氧化物酶的含量来间接测定生物素的含量。结果显示健康成年男性和女性尿中生物素含量分别为(9. 0 ± 5. 4) 及(7. 0 ± 2. 1)μmol/mol肌酐,该方法在100 ~ 1000 pmol/L的回收率分别为108%及112. 5%,对实验结果存在高估现象。ELISA法专一性强,快速且灵敏,可以自动化; 但是试剂盒价格昂贵,结果受操作因素影响较大,结果不稳定。
  
  3. 3 H14CO3-incorporation assay
  
  H14CO3-incorporation assay利用PCC将14C-碳酸盐整合到甲基丙二酰辅酶A上,通过测定甲基丙二酰辅酶A活性来间接判断生物素的水平。STRATTON等[12]测定8个健康成年人在服用足量生鸡蛋蛋白后PCC活性的变化: 在第14天时所有受试者PCC活性均将至第0天正常水平的下限。验证了生物素水平与PCC活性之间的线性关系。PCC活性不依赖于肾功能,对于肾功能下降或特殊生理状况人群( 如孕妇) 的测定结果不受影响。但其测定技术要求比较高。在样品处理过程要保持PCC活性; (1) 分离过程中,要避免溶血; (2) 样品处理时间要短,避免PCC活性绝对值下降; (3) 避免血液中PCC活性随着样品处理过程发生变化; (4) 不适于人体长期的生物素营养状况的检测工作。
  
  3. 4蛋白质印迹法
  
  蛋白质印迹法将电泳分离后的羧化酶从凝胶转移到固相支持物PVDF膜上,然后用特异性抗体检测特定抗原的技术。日本学者ENG等[15]使用Western Blots法测定血清羧化酶活性,结果发现: (1) 仪器检测到的holo-PC的信号太弱;ACC未检测到; (2) 生物素缺乏组MCC、PCC的丰度为4. 1、4. 1; 生物素足量组为8. 2、9. 1,添加生物素组为15. 7、17. 0.链霉素亲和素-HRP检测,避免放射性标记过程,特异度较高,可利用条带光密度定量分析。但是该方法在制胶、跑胶方面要求比较高,且无法检测ACC活性,有待改进。
  
  3. 5色谱测定技术
  
  3. 5. 1 HPLC-Avidin binding assay高效液相色谱法在生物素测定方面受到一定的限制。传统的色谱柱无法将生物素与其他干扰物质有效分离开来。1990年美国学者MOCK利用生鸡蛋蛋白( 含抗生物素蛋白) 与生物素特异性结合作用,采用色谱技术将生物素与其它物质分开的原理,建立了HPLC-Avidin binding assay测定生物素含量。该方法不仅可以测定血浆和尿中总的生物素含量,还可以测定各种结合形式的生物素。MOCK等[16]测定健康成年人血清生物素含量,结果表明血清中共价结合生物素占12%,可逆性结合生物素占7%; 游离 态 生 物 素 占81% .随 后MOCK等[17-18]使用该方法分离出血浆、尿中生物素的代谢产物,15个健康成年人血浆生物素含量为(244 ±61)pmol / L,代谢产物双降生物素含量为 (189 ±135)pmol / L、生物素硫氧化物含量为 (15 ± 33)pmol / L.测定10个健康成年人尿中生物素的含量为(41 ± 18)nmol/24 h肌酐,代谢产物双降生物素含量为(26 ± 10)nmol/24 h肌酐、生物素硫氧化物含量为(10 ± 5)nmol/24 h肌酐,尿中生物素占总生物素约43%,双降生物素占29%,硫氧化物占约11%,未知成分占17% .抗生物素蛋白不仅可与生物素及其衍生物结合,还可与脂酸结合,同时与酸性乙醇磷酸缓冲液中其它干扰物质的峰区分不明显,测定方法有待进一步改进。
  
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魏九玲,王竹. 生物素营养状况评价方法[J]. 卫生研究,2016,(02):302-305. 转载请注明来源。原文地址:http://www.lw54.com/html/zhlw/20191001/8203294.html   

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