固相萃取HPLC法测定保健食品中的阿魏酸含量

阿魏酸具有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂、防治冠心
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阿魏酸具有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌、抗病毒、抗病变和防癌等作用[1],是用于改善免疫力、缓解体力疲劳类保健食品的功效成分,其质量状况直接关系到人们的身体健康。目前,国家尚未制定保健食品中阿魏酸检测的国家标准、行业标准,有关阿魏酸的检测方法大多是药材和中成药中阿魏酸含量的检测[2-5]。但由于保健食品种类繁多,成分复杂,干扰因素多,在前处理方面与药物制剂和药材有很大不同。本文对样品预处理进行了改进,建立了采用固相萃取HPLC 法测定保健食品中阿魏酸的快速、灵敏、准确的检测方法,并用于实际样品的监测,获得了满意的结果。方法回收稳定,精密度好,为保健食品的安全监管提供便利。

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪(1260):美国Agilent 公司;萃取柱(Dionex OnGuard II RP 柱,2.5cc):美国Thmero 公司;离心机(3K15):Sigma 公司;氮吹仪(EVA50A):北京普利泰科仪器有限公司;分析天平(BT25S):赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2 试剂与材料

对照品阿魏酸:中国药品生物制品检定所;甲醇:色谱纯,美国FISHER 公司;甲酸:色谱纯,美国Sigma 公司;乙酸:色谱纯,美国Sigma 公司;超纯水:由Milli-Q 超纯水系统制备,其他试剂均为分析纯;样品:市售某品牌鹿胎盘胶囊。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱(250mm×4.6mm×5μm);柱温:25 ℃;洗脱方式:1%乙酸溶液-甲醇(55∶45)为流动相等度洗脱;流量:1.0mL/min;检测波长:320 nm;进样体积:10μL。

1.3.2 标准溶液配制准确称取适量的阿魏酸标准品,用流动相配制成1.0mg/mL 的标准储备溶液,以流动相逐级稀释配制5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、30.0μg/mL、40.0μg/mL、50.0μg/mL 系列浓度的阿魏酸标准使用液。

1.4 样品处理

1.4.1 样品提取精密称量样品2.00g 于50mL 具塞离心管中,加入30mL 甲醇—甲酸(95∶5),涡旋震荡2min,然后以8000r/min 离心5min,待净化。

1.4.2 样品净化采用Dionex OnGuard II RP 柱(2.5cc)净化,RP 柱用10mL 甲醇活化放置10min 后使用,取待净化清液过RP 柱(弃去前5mL 滤液),准确移取2.0mL 净化液氮吹至干,然后用流动相定容至2.0mL,经0.22μm 有机相滤膜过滤后供液相色谱分析。

2 结果和讨论

2.1 检测波长的选择

通过对100μg /mL 的阿魏酸进行200~400nm 范围的紫外扫描,结果发现阿魏酸在320nm 有最大吸收。本文选择320nm为检测波长。图1 阿魏酸标准溶液200~400nm 光谱图。

2.2 流动相的确定

在ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱上用甲醇———水作流动相分离保健食品中阿魏酸,阿魏酸峰型差。根据阿魏酸的化学性质,考虑采用酸性流动相可以获得较好效果。改用1%乙酸溶液替代水可以改变阿魏酸峰型,且能较好地与干扰杂质分离,图2 中峰1(tR=5.34 min)为阿魏酸标准溶液的色谱峰,图3 是样品中阿魏酸色谱图(tR=5.32 min)。

2.3 提取方式的确定

据文献报道,用甲醇∶甲酸(95∶5)作溶剂,阿魏酸稳定性良好[6]。本试验采用振荡提取、超声抽提、漩涡提取等不同提取方法进行研究, 实验结果表明,称取样品约2.0g 于50mL具塞离心管中(3 份),准确加入30mL 甲醇∶甲酸(95∶5),分别振荡提取12h,超声提取20min,漩涡提取2min,静置,取上清液过Dionex OnGuard II RP 柱(2.5cc)净化后,色谱条件下进样10μL,结果见表1。

由表1 可知,振荡提取12h,超声提取20min,漩涡提取2min,含量基本无变化,因此为提高检测效率选用漩涡提取2min。最优提取阿魏酸条件是提取溶剂甲醇∶甲酸(95∶5)、提取方式漩涡提取2min。

2.4 固相萃取柱的选择

保健食品多属于中药复方产品,含有多种提取药材,功效因子相互干扰,功效成分不易分离、定量测定。本文使用Dionex OnGuard II RP 柱固相萃取柱是利用固体吸附剂将样品中的弱极性干扰物,如脂肪等保留,从而得到纯净的溶液,达到有效去除保健食品中杂质的目的。实验表明,经能获得较好的回收率,故采用Dionex OnGuard II RP 柱作为样品预处理柱。

2.5 回收率与精密度

精密量取2.0g 同一浓度样品6 份,每份加入浓度为0.50mg/mL 对照品溶液0.6mL,按文中1.4 项的操作方法进行处理与测定,并与标准曲线同时进行,以当时的标准曲线计算样品的测得浓度,求得本法的精密度与回收率,数据见表2。结果表明,有较好的回收率与良好的精密度,平均回收率为96.6%,其RSD为3.2%。

2.6 线性范围和检测限

本方法的线性范围为5.0μg/mL~50μg/mL。配制5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、30.0μg/mL、40.0μg/mL、50.0μg/mL 阿魏酸标准溶液,在选定的仪器条件下进行色谱分析,每个浓度点重复测定3次,测得峰面积平均值对浓度绘制标准曲线。

图4 标准曲线数据显示,阿魏酸在5.0μg/mL~50μg/mL表现出良好的线性关系,计算回归方程为Y=41.09X-5.29,相关系数为r=0.9996。

以3 倍基线噪音所相当的待测物质的量计算,当取样量为2g,进样量为10.0μL 时,保健食品中阿魏酸的检出限为0.3mg/100g。

2.7 样品测定结果

利用此方法对某品牌鹿胎盘胶囊进行检测,结果为32.67mg/100g。

3 结论

应用固相萃取HPLC 法测定保健食品中阿魏酸含量具有灵敏度高、精密度和准确度好等优点,可作为保健食品中阿魏酸含量分析的检测方法。Dionex OnGuard II RP 柱具有良好的吸附性能,能有效去除样品中的弱极性干扰成分,获得较好的回收率、重现性和较低的检出限。本方法简单、快速、经济,能够满足保健食品中阿魏酸的监测需要,适用于实验室批量检测分析。

参考文献

[1]欧仕益,包惠燕,蓝志东.阿魏酸及其衍生物的药理作用研究进展[J].中药材,2001,24(03):220-221.

[2]张惠,李祥,周红燕,等.HPLC 法测定脉络宁注射液中阿魏酸含量[J].医学进展,2008,32(12):556-558.

[3]毕跃峰,田野,裴珊珊,等.金银花化学成分分析[J].郑州大学学报,2007,39(02):184-186.

[4]李波霞,魏玉辉,段好刚,等.HPLC 法测定四物合剂中芍药苷和阿魏酸的含量[J].中国药房,2008,19(36):2853-2854.

[5]程东岩,王隶书,王海生,等.高效液相色谱法测定慈航颗粒中阿魏酸的含量[J].中国实验方剂学杂志,2008,14(11):16-17.

[6]黄罗生,郭健新,刘咏梅,等.HPLC 测定阿魏酸含量的探讨[J].中成药,2004,26(02):134-136.

作者简介:马桂娟,硕士,工程师,研究方向:食品检测。

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