除草剂生物测定方法及操作方法

生物测定技术是除草剂研究的一项基本工作,是除草剂活性测定、安全性检测以及残留诊断的常用方法,特别是在除草剂新品的研制开发中发挥着不可替代的作用,也是高通量筛选中必不可少的手段之一[1]。 1 除草剂生物测定方法 除草剂生物测定的主要方法有:点滴法、小杯法或
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生物测定技术是除草剂研究的一项基本工作,是除草剂活性测定、安全性检测以及残留诊断的常用方法,特别是在除草剂新品的研制开发中发挥着不可替代的作用,也是高通量筛选中必不可少的手段之一[1]。

1 除草剂生物测定方法

除草剂生物测定的主要方法有:点滴法、小杯法或培养皿法、浮萍法、玉米幼苗法、黄瓜幼苗法、燕麦幼苗法、萝卜子叶法、番茄水培法、稗草胚轴法等[2]。除草剂具有控制生长激素的分泌,干扰蛋白质、叶绿素、脂类等的生物合成,抑制光合作用、细胞分裂、呼吸作用等多种作用方式,利用生物活体作为靶标是生物测定中的一种常规选择,生物测定中靶标生物的生长发育情况、生理生化指标以及形态特征的变化可作为除草剂生物活性的判定依据。另外,在进行除草剂生物测定时,除草剂的不同作用方式决定了靶标生物和测定方法的选择。

1.1 组织或器官水平测定

组织或器官水平测定常用的有叶片、种子、根尖等,一般在实验室进行。选用种子作为生物测定的供试材料时,通常采用小杯法或培养皿法。培养皿法的培养介质一般是常规自来水,在培养皿内垫上两层滤纸,把一定数量的种子均匀地铺在滤纸上,提前把需要测定的除草剂按事先设定好的浓度梯度进行稀释,再用移液枪将不同浓度梯度的除草剂加入培养皿,放入培养箱,设定好适宜的温度和湿度,进行培养。小杯法可以采用灭菌、过筛的沙子,均匀地将细沙填充到小杯的固定位置,把一定数量的种子均匀铺设到沙子上,再覆盖上厚度基本一致的细沙。可以用地上植株鲜重、株高或主根长作为测量指标,具体采用哪项指标应依据预备实验结果来确定,但是选定的指标应具备稳定性好、相关性好以及容易测量的特点。以主根长生测法应用最为广泛。例如采用油菜或玉米主根长生测法测定磺酰脲类除草剂残留活性[3,4]。在选用种子作为生测材料时, 供试的种子一定是近一年或两年的,必须进行预实验,确保种子发芽率高、发芽势稳定,否则会影响试验结果。

1.2 整株水平测定

采用整株植物测定除草剂的活性,通常是在温室进行。用不同规格的花盆或培养皿等培养供试植物,然后根据试验预设,把供试除草剂按一定浓度梯度进行稀释,用喷雾法对供试植物进行处理,根据除草剂特性,待除草剂作用症状明显后分两次进行观察、测量、记录、评价。评价的指标为株高、鲜重、死亡率等,还可对植物受害症状进行分级,再计算综合药害指数[5]。根据供试植物出现的除草剂作用的显著症状进行等级划分,从无明显症状到症状最明显可分为5~7 级,然后对每一个培养皿或花盆中供试植物的除草剂作用症状进行统计记录,计算药害综合指数,最后依据药害综合指数判定除草剂活性。

药害综合指数(%)= [(每皿或每盆各受害级别株数×级别)/(每皿或每盆株数×最高级别)]×100。

也可以用鲜/ 干重抑制率来进行等级划分,唐庆红等人研究油菜田新型除草剂丙酯草醚的杀草谱,对20 种供试杂草根据其对丙酯草醚反应程度进行划分,分成了五类,分别为很敏感(防效大于90%)、敏感(防效位于80%~90%)、中度敏感(防效位于60%~80%)、一般耐药(防效位于30%~60%)以及耐药杂草(防效低于30%)。研究结果表明,在600g a.i/hm2 的推荐剂量下,以鲜重防效为评价指标,看麦娘、日本看麦娘、早熟禾、荠菜、草、牛繁缕、棒头草、刺果毛茛、硬草和小藜等10 种杂草对丙酯草醚较敏感和敏感。

1.3 酶水平测定

在酶水平上进行的生物测定,前提是已知该除草剂的作用靶标。例如,草甘膦的作用靶标为EPSP 合成酶,是芳香族氨基酸合成过程中的重要酶,通过抑制EPSP 合成酶活性可以导致莽草酸累积,所以通过测定植物体内莽草酸累积量可以确定草甘膦活性大小[6](Pline W. A. et al.,1999;Fuchs M. A.et al,2002)。另外,磺酰脲类除草剂的作用靶标为乙酰乳酸合成酶,那么植物对磺酰脲类除草剂的敏感性可以通过乙酰乳酸合成酶的活性变化来判定[7]。

1.4 细胞或细胞器水平测定

特定作用机制的除草剂可采用细胞或细胞器水平测定,其中又以线粒体和叶绿体中的特定生理生化反应的测定居多。在离体线粒体中,可以采用瓦氏呼吸装置测定氧的吸收和磷氧比,进而确定呼吸作用抑制剂类除草剂的活性[8]。三氮苯类等光合作用抑制剂类除草剂作用于光系统Ⅱ中质体醌QB结合部位,替换与D1 蛋白结合的质体醌QB,致使电子传递受阻,这类除草剂可以测定希尔反应活性,通过测定铁氰化钾光还原,折算成放氧活力,能很好地反映除草剂的除草活性[9]。另外,细胞器中特定物质含量的测定也可以作为测定指标用于除草剂活性评价,如叶绿素含量测定,在用于新型磺酰脲类除草剂HNPC-C9908 活性测定时,藻细胞中叶绿素含量随供试药剂浓度的增加而逐渐降低,表现出良好的剂量———效应关系[10]。

2 除草剂生物测定操作方法

2.1 生物测定中供试生物体的选择

在除草剂的生物测定中,常常以植物为主,但特殊情况情况下也可选用其他生物。在实际操作中,根据实验目的不同选择不同的作物或者杂草。比如需要测定除草剂对特定作物或杂草的生物活性,以特定的作物或杂草为实验材料;需要测量除草剂在土壤或水体中的残留量,就要先通过预实验或者实际经验筛选敏感植物,之后通过一系列的实验设计用敏感植物在土壤或水中的生存情况来确定残留情况。一般来讲,生物测定中选择供试植物应遵循以下几个原则:一是供试植物来源要充分、个体应基本一致;二是供试植物对除草剂反应是有规律性的,比如一定范围内剂量和死亡率(或生理生化指标)成一定的相关性(正相关或负相关)等;三是现象具有可重复性,即相同或相似实验条件下,正相关的关系效应可以重复显现。在材料选择上,主要以高等被子植物作为生测材料,有时也可选用低等生物如藻类作为生测材料,主要是藻类作为低等生物,材料生长均匀一致性高、生长周期短、生理生物指标显现明显,准确性较高。实际操作中,对于实验条件较为完善、实验设备较为齐全的研究室,可以考虑开展藻类生物测定。对于基层实验单位,比如农业技术推广系统、基层农业广播学校等技术员培训机构,则建议采取作物或杂草作为指示植物,更利于操作和观察。

2.2 生物测定中除草剂浓度的设置

除草剂的生物测定中,需要做系列浓度(或剂量)设置,可以采用等差或等比数列的方式,原则上浓度(或剂量)设置应在5 个以上,并且设置空白对照或清水对照,必要时还要设置标准样品对照或当地常用除草剂对照。供试除草剂的浓度设置应在靶标植物的正常响应范围内,通常认为靶标植物对供试除草剂的反应在0%~90%时的浓度(或剂量)设置是比较合理的,可以获得较为准确的回归方程,应用该回归方程计算出EC10、EC50 、EC90 等试验所需浓度(或剂量)。为保证试验条件的一致性和试验结果的可比性,试验前应先将原药配制成一定浓度的母液后,采用梯度稀释的方法进行;试验方法也应按照除草剂的使用方法,选择喷雾处理或土壤处理。喷雾处理中,喷雾设备性能要良好,雾滴要均匀一致,如不具备良好的喷雾设备,可采用滴定法,即用微量移液器将定量药液滴在供试植物的特定部位,如植物第二展开叶,该方法可以避免喷雾雾滴不匀造成的人为误差。采用土壤处理时应先配制成一定浓度的毒土,用相同土壤逐步稀释成梯度浓度,均匀撒适于相应处理中[11]。所有试验浓度(或剂量)都应重复3 次以上。

2.3 生物测定在新农药筛选中的应用

筛选目标化合物除草活性的一般步骤为:1. 确定生物活性,在相同植物试材,相同剂量下,进行新化合物普筛,明确化合物活性。2.确定活性大小,通过设置梯度浓度,初步确定目标化合物的活性大小。3.确定除草剂作用特点和特性,通过不断筛选、复筛,逐渐增加靶标杂草的种类和扩大试验作物的范围,对除草剂自身特性和使用特点进行研究,确定应用剂量、除草剂选择性、杂草谱和应用阶段,进而确定对作物的安全性以及除草剂残留消解动态等[12,13]。目前,新农药创制中,生物测定时普遍采用培养皿法,也就是种子萌发法。具体做法是将靶标生物种子放入铺有双层滤纸的培养皿内,用移液枪加入稀释成梯度浓度的目标除草剂,放入人工气候箱内进行培养,7 天后对种子生物指标进行统计,通过发芽率、鲜重、根或茎的抑制情况等数据计算抑制中浓度,从而判断比较目标除草剂生物活性[14]。种子萌发法在除草剂新化合物筛选上具有一定的局限性,对氨基甲酸酯类除草剂具有很高的筛出率,但难以检出大部分光合作用抑制型除草剂[2],因此在除草剂新化合物筛选上应进一步拓展新方法、新思路,避免化合物的错选、漏筛。

参考文献

[1]宋小玲,马波,皇甫超河,等.除草剂生物测定方法[J].杂草科学,2004(03):1-5.

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[3]姚东瑞,陈杰,宋小玲,等.绿磺隆在三种土壤中的降解[J].江苏农业学报,1998,14(04):215-219.

[4]范志金,钱传范,陈俊鹏,等.单嘧磺隆对小麦的安全性及在麦田除草效果的研究[J].中国农学通报,2003,19(03):4-8.

[5]褚秋华,朱云枝,强胜.苯噻酰草胺·苄嘧磺隆室内配方筛选试验[J].杂草科学,2002,(04):15-17.

[6]Pline W. A., Wu J. R., Hatzios K.. Effects of temperatureand chemical additivies on the response of transgenic herbicide-resistantsoybeans to glufosinate and glyphosate applications [J]. PesticideBiochemistry and Physiology,1999,65:119-131.

[7]谢娜,毕亚玲,李凌绪,等.不同玉米品种对氯吡嘧磺隆的耐药性差异及其机制[J].植物保护学报,2012,(06):567-572.

[8]强胜.杂草学[M].北京:中国农业出版社,2001.

[9]谭惠芬,刘华银,杨华铮.希尔反应测定中新型抑制剂活性的鉴定方法[J].植物生理学通讯,1998,34(02):126-129.

[10]欧晓明,雷满香,黄明智,等.新除草剂HNPC-C9908 对小球藻生长的影响研究[J].农药学学报,2003,5(03):16-23.

[11]宋小玲,马波,皇甫超河,等.除草剂生物测定方法[J].杂草科学,2004,(03):1-5.

[12]陈万义,薛振祥,王能武.新农药研究与开发[M].北京:化学工业出版社,1999.

[13]陈年春.农药生物测定技术[M].北京:北京农业大学出版社,1991:208-230.

[14]王树凤,徐礼根,马建义,等.除草剂生物筛选研究进展[J].农药学学报,2002,4(04):3-9.

作者简介:谢娜,硕士研究生,林业工程师,研究方向:农药毒理与有害生物抗药性。

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