僵蚕七种化学成分抗肿瘤活性的初步研究

肿瘤是继人类心脑血管疾病之后的第二大疾 的重要课题.从药用动植物中挖掘抗肿瘤活性成分 病.寻找有效的抗肿瘤药物和方法是世界 医学 面临 是当今肿瘤药物研究和开发的重要途径之一,而且其有效性优势越来越明显,紫杉醇、喜树碱和长春 碱等从药用植物中发掘的抗肿瘤活
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  肿瘤是继人类心脑血管疾病之后的第二大疾 的重要课题.从药用动植物中挖掘抗肿瘤活性成分 病.寻找有效的抗肿瘤药物和方法是世界医学面临 是当今肿瘤药物研究和开发的重要途径之一,而且其有效性优势越来越明显,紫杉醇、喜树碱和长春 碱等从药用植物中发掘的抗肿瘤活性化合物已经开 发成广谱性的抗肿瘤药物并被广泛推广应用.僵蚕 (Bombyx batryticatus)为蚕蛾科昆虫家蚕幼虫期感 染白僵菌(Beauveria bassiana)而致死的干燥全 虫,含有蛋白质、脂肪酸、氨基酸、草酸铵、白僵 菌素以及微量元素等成分12 .传统中医理论认为 僵蚕具熄风止痉、活血通络和化痰散结等功效,而 现代药理学研究发现僵蚕提取物具有抗凝、抗血 栓、抗惊厥、降糖和降脂等作用卜5],目前多用于 治疗癫痈、顽固性头痛等疾病[6 7].僵蚕也常作为 脑血栓、脑栓塞、脑梗塞、脑中风和脑出血后遗症 等治疗药物的原料.近年来有研究证实僵蚕对癌症 具有一定治疗作用[8],有研究者从僵蚕内分离和 鉴定出麦角甾醇、棕榈酸、赤藓醇、(5 -豆甾醇、 甘露醇、胡萝卜苷和尿嘧啶等7种化学成分,其中 前6种为首次从僵蚕中分离得到M,而这7种僵蚕 来源的化学成分的药物性质和药理作用在国内外鲜 有报道,本试验以B16~F10小鼠黑色素瘤细胞和 A375人黑色素瘤细胞为模型,针对僵蚕内证实存 在麦角甾醇、棕榈酸、赤藓醇、p -豆甾醇、甘露 醇、胡萝卜苷和尿嘧啶等7种物质的抗肿瘤活性进 行初步研究,希望能够为其抗肿瘤机理的研究奠定 理论基础.

  

  1材料与方法

1.1材料麦角甾醇、棕榈酸、赤藓醇、p -豆甾醇、甘 露醇、胡萝卜苷和尿嘧啶,纯度均在质量分数 90%以上,购自SIGMA公司;B16~F10小鼠黑色 素瘤细胞和A375人黑色素瘤细胞购自美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection, ATCC) ; 3 - (4,5- 二甲基_唑-2) -2,5- 二苯 基四氮唑溴盐(MTT)、二甲亚砜(Dimethyl sul?foxide ,DMSO)购自SIGMA公司;DMEM培养基 (Dulbecco's modified eagle medium)、牛胎血清,购 自英杰生物技术公司.


  1.2方法


1.2. 1细胞培养把B16~F10小鼠黑色素瘤细胞 和A375人黑色素瘤细胞接种于含体积分数10%胎 牛血清的DMEM培养基中,5%CO2, 37 °C,饱和 湿度下常规培养.供试化合物用DMSO溶解成1 mol/L储存液-20 C保存,使用前用培养基稀释 成所需浓度.

  

  1.2.2MTT细胞活力检测取对数生长期的B16- F10和A375细胞,PBS洗涤,胰蛋白酶消化,用 培养基稀释并调细胞密度到8 x 104?1 x 105 个/mL,以每孔100斗接种于96孔板中,实验设 空白调零组(只加等体积的培养液)和用麦角甾 醇、棕榈酸、赤藓醇、p -豆甾醇、甘露醇、胡萝 卜苷和尿嘧啶处理组,试样处理组分6个不同浓度 梯度,分别为 1.0、0.5、0.25、0.13、0.065 和 0 mmol/L.每处理设6个重复,在常规培养条件下 培养72 h后,每孔加入质量浓度为5 mg/L的MTT 10 mL,再培养4 h,然后弃掉培养液,每孔加入 150 ^L DMSO,室温下避光低速振荡15 min,使结 晶物充分融解.选择570 nm波长,酶联免疫检测 仪(Bio~RAD公司)测定各孔光密度值仏7。_,记录结果, D570nm = D570nm实验组-D570nm调零组?以药物处理浓度对光密度值Dm nm绘制细胞活力变化曲线, 与对照处理组相比,如曲线变化趋势随加药浓度增 加明显下降,则对应药物对细胞活力具有明显抑制 作用.

  

  1.2.3数据处理利用Microsoft Excel软件对数 据进行统计分析,制作曲线图.

  

  2结果


2. 1麦角甾醇的抗肿瘤活性分别用不同浓度的麦角甾醇(0.065、0.13、0. 25、0.5 和 1. 0 mmol/L)处理 B16-F10 小鼠黑色 素瘤细胞和A375人黑色素瘤细胞,麦角甾醇能够 不同程度地抑制该两种细胞的生长,并呈现出明显 的浓度依赖性,其中在0.13 mmol/L以上的处理浓 度抑制作用更明显(图1)

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2.2p -谷甾醇的抗肿瘤活性分别以不同浓度的P -谷甾醇(0.065、0.13、0. 25、0.5 和 1. 0 mmol/L)处理 B16~F10 小鼠黑色 素瘤细胞和A375人黑色素瘤细胞,[3 -谷甾醇能 够不同程度地抑制两种细胞的生长,并呈现出明显 的浓度依赖性,其中0. 13 mmol/L以上的处理浓度 抑制作用更明显,而且高浓度的(3 -谷甾醇(0.25 mmol/L以上)对B16~F10细胞的抑制作用明显高 于A375细胞(图2).

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  2.3 棕榈酸的抗肿瘤活性经不同浓度的棕榈酸(0.065、0.13、0.25、0. 5和1. 0 mmol/L)处理B16-F10小鼠黑色素瘤细 胞和A375人黑色素瘤细胞,发现棕榈酸可不同程 度地抑制两种细胞的生长,并呈现出明显的浓度 依赖性,其中0.25 mmol/L以上的处理浓度抑制 作用更明显,而且0. 25 mmol/L以上的浓度对B16-F10细胞的抑制作用明显高于A375细胞 (图 3).

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  2. 4赤藓醇的抗肿瘤活性不同浓度的赤藓醇(0.065、0.13、0.25、0.5 和1. 0 mmol/L)对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞的 生长没有显著抑制作用,而高浓度的赤藓醇(1.0 mmol/L)对A375人黑色素瘤细胞具有一定的促生 长作用(图4).

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  2.5 甘露醇的抗肿瘤活性不同浓度的甘露醇(0.065、0.13、0.25、0.5 和1. 0 mmol/L)对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞的 生长无明显抑制作用,而同样浓度甘露醇对A375 人黑色素瘤细胞表现出一定的促生长作用,但未呈 现浓度依赖性(图5).

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  2.6 胡萝卜苷的抗肿瘤活性不同浓度的胡萝卜苷(0.065、0.13、0.25、0. 5和1. 0 mmol/L)对B16~F10小鼠黑色素瘤细胞 的生长无明显抑制作用,而同样浓度的胡萝卜苷对 A375人黑色素瘤细胞表现出一定的促生长作用, 但未呈现浓度依赖性(图6).

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  2.7 尿嘧啶的抗肿瘤活性以不同浓度的尿嘧啶(0.065、0.13、0.25、0. 5和1. 0 mmol/L)处理B16~F10小鼠黑色素瘤细 胞和A375人黑色素瘤细胞,两种肿瘤细胞的生长Daucosterol on tumor cell growth

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3讨论


僵蚕作为一种重要的传统中药,有关其药理作 用的研究已有不少报道,主要集中在抗凝血、抗血 栓、降糖和降脂肪方面的研究M?僵蚕通过抑制 凝血酶活性,激活纤溶酶,促进血中纤维蛋白原降 解,降低血浆及全血黏度,抑制血液凝固和血栓形 成^],并且对士的宁所引起的小鼠惊厥以及抑制 癫痫发作有效[8] ?僵蚕组分抗肿瘤方面的研究不 多,但僵蚕提取物对小鼠艾氏腹水瘤细胞ECA有 明显的抑制作用,而且体外试验可抑制人体肝癌细 胞的呼吸作用[12] ?僵蚕蛹50%煎剂每日给小鼠灌 胃,对小鼠肉瘤细胞S180也有抑制作用 ?本试 验以B16~F10小鼠黑素瘤细胞和A375人黑色素瘤 细胞为模型,对僵蚕内的证实存在的麦角甾醇、2 -谷甾醇、棕榈酸、赤藓醇、甘露醇、胡萝卜苷 和尿嘧啶等7种化合物的抗肿瘤活性研究进行初步 研究,结果表明前3种化合物的抗肿瘤活性明显, 而后4种化合物对2种肿瘤细胞的抑制作用不明 显.麦角甾醇、、S -谷甾醇是甾体类化合物,大量 研究表明麦角甾醇和p-谷甾醇具有显著的抗肿瘤 活性.酵母中提取的麦角甾醇对乳腺癌细胞有较强 的抑制作用[13],巴西菇中提取的麦角甾醇能显著 抑制胃癌、肝癌细胞生长[14] ? p -谷甾醇能够通过 抑制肿瘤细胞增殖而抑制结肠癌、乳房癌、肺癌、 前列腺癌和肝癌细胞等的发生或发展[1519] ?然而 有关麦角甾醇、p -谷甾醇以及其他植物甾醇抗黑 素瘤细胞的研究未见报道.本试验证明两种甾醇均 具有抗黑素瘤活性,另一方面两者是僵蚕的重要化 学组分,在僵蚕的抗肿瘤活性中起着重要作用.棕0 0.065 0.130 0.250 0.500 1.000 尿P密卩定 Uracil/(mmol/L)

  

  榈酸是动植物广泛存在的高级饱和脂肪酸,主要用 于日用化工、食品等领域,如棕榈酸与维生素C 酯化合成的维生素C棕榈酸酯具有强烈的抗氧化 活性,被广泛用作营养强化剂和药物辅助剂[2°] ? 环胞苷和棕榈酸酯化形成具有抗癌活性的复合物环 胞苷二棕榈酸酯[21],然而有关棕榈酸单体的药理 药用研究未见报道.本试验首次证实棕榈酸具有抗 肿瘤活性,既为棕榈酸的药用研究提供了新思路, 也证实棕榈酸在僵蚕抗肿瘤活性中发挥着作用.综 合分析表明麦角甾醇、p -谷甾醇、棕榈酸作为僵 蚕的化学组分在其抗肿瘤活性中起着重要作用,本 试验对弄清僵蚕的抗肿瘤作用成分及其作用机理具 有一定意义


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