他拉达非对肺动脉高压模型大鼠降钙素基因相关

肺动脉高压(PAH)是以平滑肌细胞增生、肺血管收缩及重构 为特征的疾病,能引起患者右心室肥厚、肺血管阻力增加最终导 致患者右心衰竭和死亡。近年的研究显示,血管重构是PAH发生 和发展的重要病理生理机制,肺动脉平滑肌细胞的过度增殖与迁 移是引起血管重构的关键因素
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  肺动脉高压(PAH)是以平滑肌细胞增生、肺血管收缩及重构 为特征的疾病,能引起患者右心室肥厚、肺血管阻力增加最终导 致患者右心衰竭和死亡。近年的研究显示,血管重构是PAH发生 和发展的重要病理生理机制,肺动脉平滑肌细胞的过度增殖与迁 移是引起血管重构的关键因素[1]。降钙素基因相关肽(CGRP)是 感觉神经的重要递质,是目前已知最强的舒血管物质,在调节血 管阻力和维持血压稳定等方面有重要作用[2],而p27及ERK1 /2 参与的信号通路在调节血管平滑肌细胞增殖及血管重构方面亦 有重要作用。他达拉非为5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂,广泛应 用于治疗肺动脉高压,但其作用机制尚未完全明了。本研究中基 于CGRP具有降压及抑制血管重构的作用,探讨了 CGRP及 ERK1 /2/p27在他达拉非降低肺动脉高压、预防缓解肺血管重构 中的作用,现报道如下。

  

  1 材料与方法


1.1 仪器、试药与动物仪器:Model680型酶标仪(美国Bio-Rad公司);光学显微镜 (曰本Olympus公司);BL-410型多功能生理记录仪(成都泰盟 科技有限公司);Mini PROTEAN电泳系统(美国Bio - Rad公司)。

  

  试药:盐酸他达拉非片(美国Elilillyand公司,国药准字 H20120472,规格为每片20 mg),药片粉碎后溶于10 mL生理 盐水备用;野百合碱(MCT, Sigma公司,批号为063K1183),溶于1 mol/L稀HCl溶液,制成1%浓度溶液,调pH至7. 2,加生理盐 水配制成10 g/L MCT溶液。兔抗鼠CGRP多克隆抗体(美国Sigma 公司);小鼠抗大鼠p27单克隆抗体、小鼠抗大鼠ERK1 /2单克隆 抗体、小鼠抗大鼠p- ERK1 /2单克隆抗体、小鼠抗大鼠GADPH 单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。

  

  动物:36只健康雄性SD大鼠,SPF级,体重180?200 g,由南 方医科大学动物实验中心提供,许可证号SCXK(粵)2011 -0015。 动物饲养及所有操作流程均遵守《实验动物管理条例》,可自由进 食及饮水。

  

  1.2 方法动物模型建立:适应性饲养5 d后,将36只雄性SD大鼠随 机分为3组,每组12只,A组为MCT诱导肺动脉高压(PAH)组, B组为他达拉非组,C组为对照组。A组、B组大鼠给予皮下注射 已配制好的MCT溶液60 mg/kg, C组给予腹部注射相应剂量生 理盐水,相同条件下喂养,自由饮食、饮水。4周后,动物模型经胸 体彩超鉴定后,B组大鼠给予0. 5 mg/(kg ? d)他达拉非溶液灌胃 处理,A组、C组给予相同剂量生理盐水灌胃处理,相同条件饲养 4周后,取材进行相关检测。

  

  血流动力学及右心室肥厚病变分析:试验中大鼠水合氯醛腹 腔麻醉后将右心导管预充肝素盐水后与压力换能器相连,用 20号套管针经右心室穿刺至肺动脉主干记录肺动脉收缩压(PASP)及平均肺动脉压(mPAP);处死大鼠,结扎主动脉,取心、肺, 经生理盐水漂洗后结扎肺动脉,分离心脏,秤取游离右室壁和左 室+室间隔质量(RV, LV + S),计算右心肥厚指数RV/(LV + S)。

  

  肺血管形态学观察:石蜡包埋固定并切片,将切片经HE染 色后置于显微镜下观察,随机选取直径50?150 ^m肺小动脉标 本,用图像分析技术计算肺血管内外管径均值,管壁厚度(WT), 膜厚度占管腔比例(WT, % ) =2 xWT/ED,管壁横截面面积占管 腔面积的比例(WA, % ) = (TA- IA) /TA。

  

  Western Blot法分析CGRP, p27及ERK1 /2表达水平:在液 氮中将肺动脉研磨成粉末加200 ^L裂解液(50 mmol/LTris - HCl pH = 8. 0,150 mmol /L PMSF, 0. 1% NP - 40,蛋白酶抑制剂)。4 °C 12 000 r / min离心15 min,取上清,米用Bradford法检测蛋白浓 度;取上述制备的蛋白样品50 ^g上样到15%SDS-PAGE凝胶, 电泳完毕后将蛋白电转至NC膜,用5%脱脂奶粉封闭,分别加一 抗,37 V孵育2 h,经0. 1%TBST漂洗后加二抗(1 : 2 000)室温孵 育2 h,TBST洗膜后加ECL, X线胶片定影,扫描后用IPP 6.0进 行图像分析。

  

  1.3 统计学处理采用SPSS 19.0进行统计学分析。计量资料以X±s表示, 行t检验;计数资料行f检验。P <0. 05为差异有统计学意义。

  

  2 结果


结果见表1和表2,图1和图2。

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  氧、炎症及药物刺激能使肺血管内皮细胞结构、功能及代谢发生 紊乱,启动PAH的发生 。血管内皮损伤破坏了其屏障作用,干 扰了平滑肌细胞与内皮细胞间的内皮-肌连接作用,促进肺血管 平滑细胞过度增殖,引发肺血管重构 。而在肺血管重构的过程 中细胞周期调控相关因子在其中发挥重要的作用,27作为细胞 周期蛋白依赖性激酶(CDK)的负调节因子,能通过抑制cyclin/ CDK复合物的磷酸化,降低其活性,阻止细胞过度增殖。动物试验 研究 显示,激活ERK1 /2信号通路可促进p27的降解,导致细 胞进入细胞增殖周期。(Qin等 的研究结果显示,在肺动脉平滑肌 及细胞中CGRP能显著抑制血管紧张素n的表达,而ERK1 /2在 此过程中被激活。

  

  目前,PAH治疗的选择一般包括药物治疗、介入及外科治疗, 其中药物治疗包括钙离子拮抗剂、内皮素受体拮抗剂等肺动脉血 管扩张剂,通过阻断肺动脉高压发病的不同环节起作用,取得了 较好的疗效。但介入及外科治疗,包括肺移植、心肺联合移植及经 皮球囊房间隔造口术,手术风险大,术后并发症多[8]。他达拉非为 新型长效、具有选择性的磷酸二酯酶抑制剂,具有较好的耐受性, 能长时间扩张血管,提高运动耐量,降低恶化发生率,可显著改善 患者的生活质量[9]。

  

  本研究中,采用野百合碱建模,且后期对大鼠血流动力学变 化及右心肥厚指标分析,结果显示PAH模型组RVSP及mPAP显 著增高,他拉达非干预后下降但仍高于对照组,提示采用野百合 碱造模成功。RV / (LV + S)在模型组和干预组无显著性差异,但均 显著高于对照组,提示造模过程大鼠已经出现右心结构异常。光 镜下模型组肺动脉血管内皮细胞重症脱落,管腔不规则增厚,狭 窄甚至闭塞,管腔内残留大量红细胞,肺泡腔内见大量炎性细胞 浸润撒及WT%结果提示,经他拉达非干预后,肺小血管重构 得到改善。Western Blot法分析结果证实,A组CGRP, p27显著降 低,而p - ERK1 /2表达显著升高,与Zhang等[1。]的研究结果一 致,内源性CGRP的消耗能加重PAH血管重构,其作用机制可能 与抑制ERK1 /2磷酸化,进而上调p27的表达有关。

  

  综上所述,他拉达非能显著改善PAH模型大鼠的血管重构,CGRP、27及ERK1 /2在其中可能具有重要作用。


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