非小细胞肺癌患者外周血DC亚型与 NK细胞的关系

【摘要】 目的 探讨非小细胞肺癌患者外周血树突状细胞亚群(dc1/dc2)和机体nk细胞含量之间的关系及其临床意义。方法 采用流式细胞术检测40例肺癌患者外周血dc亚群(cd11c+dc/dc1和 cd123+ dc/dc2)、nk细胞含量及血浆il12的浓度, 并以10例健康受试者作为对照。结
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【摘要】 目的 探讨非小细胞肺癌患者外周血树突状细胞亚群(dc1/dc2)和机体nk细胞含量之间的关系及其临床意义。方法 采用流式细胞术检测40例肺癌患者外周血dc亚群(cd11c+dc/dc1和 cd123+ dc/dc2)、nk细胞含量及血浆il12的浓度, 并以10例健康受试者作为对照。结果 肺癌患者外周血cd11c+dc百分率为(0.66±0.24)%,比对照组(1.38±0.18)%明显降低(p<0.01),cd123+ dc百分率(0.28±0.17)%与对照组(0.27±0.11)%相比, 差异无统计学意义(p>0.05);肺癌患者与健康人比较,nk细胞含量及il12的浓度均降低(p<0.05)。nsclc 患者nk细胞的含量与cd11c+百分数及血浆il12 浓度均呈正相关(p<0.05),与cd123+百分数呈负相关(p<0.01)。dc各亚型百分率同患者的卡氏评分、化疗史有关联(p<0.01),nk细胞的含量与年龄相关(p<0.05)。结论 非小细胞肺癌患者dc1功能低下,il12分泌能力障碍,从而影响了nk细胞的活性。dc亚型与nk细胞含量之间以及它们与临床生物学行为之间都有一定关系。

【关键词】 肺癌 树突状细胞亚群 自然杀伤细胞

树突状细胞(dendritic cell,dc)是一种专职的抗原提呈细胞, 依据 dc起源和功能,将人外周血 dc 分为两个亚群[14]。www.bylw8.com自然杀伤(nature killer,nk)细胞在机体免疫中地位重要,外周血nk细胞的变化是反映机体细胞免疫状态的重要指标[5]。晚期非小细胞肺癌患者dc亚群的表达水平如何,它同患者机体nk细胞的关系如何,以及此二者同步检测的临床意义究竟如何,目前尚无定论。本研究对40例晚期非小细胞肺癌患者的dc亚群和机体免疫状态进行了同步检测和分析,现总结报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择

收集符合纳入标准的非小细胞肺癌患者40例,对照组10例,均为健康受试者。

1.1.1 纳入标准 (1)有明确病理诊断的iii~iv期非小细胞肺癌患者;(2)心、肝、肾和造血系统功能基本正常;(3)预计生存期在6个月以上;(4)karnofsky评分≥60分。

1.1.2 排除标准 (1)无明确病理诊断者;(2)预期生存期<6个月者;(3)合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病;(4)儿童、孕妇和精神病患者。

1.2 一般资料

按照上述条件共纳入40名患者,均为我科2006年8月~2006年12月期间的住院病人。其中男27例,女13例;年龄38~82岁,中位年龄63岁; iii期15例,iv期25例;病理类型:腺癌23例,鳞癌17例。

1.3 试剂与仪器

免疫荧光三标记 dc 检测试剂盒(3color dendritic value bundle)购自美国 becton dickson 公司,内有fitc标记的 lineage cocktail 1 (lin1),由cd3、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56系列抗原混合单抗组成, cd11cpe、cd123(抗il3r)pe,抗hladrpercp及 阴 性 同 型 对照小鼠igg1pe/igg2pe;fitc或pe标记鼠抗人cd3-并cd16/cd56+单克隆抗体,facs calibur流式细胞仪(美国 becton dickson公司生产),离心机等。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 外周血 dc1/dc2 亚型的检测 参考文献[6],取肝素抗凝外周血500μl,分装4管, 每管100μl全血, 加入lin1、抗hladrpercp、cd123(抗il3r)pe、cd11cpe及阴性对照igg1pe/igg2pe单抗,振荡混匀,室温暗处反应15min,加入2ml溶血素,混匀、裂解10min,离心弃上清,洗涤1次,加入300μl的1%多聚甲醛溶液,用facs calibur流式细胞仪每管收集50000个细胞,fsc设阈值,排除碎片干扰,用cell quest 软件获取及分析hladr/lin1点图中的hladr阳性、lin 1弱阳性和阴性的细胞群体,以cd11c和cd123荧光抗体染色阳性细胞百分率记录结果。

1.4.2 nk细胞的检测 参考文献[7],用fitc或pe标记鼠抗人cd3-并cd16/cd56+单克隆抗体,由流式细胞仪测定外周血中nk细胞含量。

1.4.3 血浆il12浓度检测 按照il12试剂盒的操作说明进行: 于96孔酶标板中每孔加入assay diluent rdif 50μl,各孔中分别加入已配制的il12标准液或已经室温融化并离心的血浆样本200μl,室温静置2h,弃上清液并用washer buffer洗涤3次,各孔中加入200μl il12结合物,室温静置2h,弃上清液并用washer buffer洗涤3次,加入200μ1底物溶液,室温避光静置20min,加入50μl终止液,静置25min后上酶标仪(450nm)读取od值,绘制标准曲线并求出各标本的血浆il12浓度。

1.5 统计学方法

应用spss13.0统计分析软件对实验数据进行统计,采用两样本均数差别的秩和检验、双变量相关分析及偏相关分析。

2 结果

2.1 外周血中树突状细胞亚型的检测

肺癌患者外周血髓系树突状细胞(mdc,cd11c+)的表达与正常对照组比较显著降低(p<0.01),淋巴系树突状细胞(ldc,cd123+)的表达与正常对照组比较差异无统计学意义(p>0.05),见图1、表1。表1 肺癌患者与健康对照组外周血树突状细胞亚型的检测结果

2.2 外周血中nk细胞活性及血浆il12浓度的检测

检测结果显示,nsclc 患者血浆il12 浓度为(3.19±0.30)pg/ml, 显著低于正常人(8.21±1.80)pg/ml (p=0.000)。nsclc患者与健康人比较,nk细胞的杀伤能力减弱,其含量为(15.51±2.15)%,低于健康对照组的(22.53±15.25)%(p=0.018),见图2、表2。

2.3 nsclc患者树突状细胞亚型、il12及nk细胞的含量之间相关性分析

对nsclc患者外周血中cd11c+、cd123+百

在fsc vs ssc散点图中划出单个核细胞区r1,然后将lin1表达阴性细胞设为r2(排除t、b、nk等细胞),再将hla-dr+cd11c+或hla-dr+cd123+设为r3(mdc或pdc)

图1 dc亚型流式细胞图

在fsc vs ssc散点图中划出淋巴细胞区r1,其中cd3-/cd16+cd56+者即为nk细胞

图2 nk细胞流式细胞图

分数与il12、nk细胞的含量进行相关性分析,见表3。结果显示,nsclc 患者血浆il12 浓度同cd11c+百分数呈正相关(p<0.05);nk细胞的含量与cd11c+百分数呈正相关(p<0.05),而与cd123+百分数呈负相关(p<0.01)。而nsclc 患者血浆il12 浓度同nk细胞的含量之间亦有关联性,即两者呈正相关(p<0.01)。表2 肺癌患者与健康对照组外周血中 nk细胞含量及t细胞亚群的检测结果表3 40例肺癌患者树突状细胞亚型与外周血il12、nk细胞含量之间的相关性表4 40例肺癌患者树突状细胞亚型与临床病理特征的关系

2.4 肺癌患者树突状细胞亚型、nk细胞含量与临床病理特征分析的关系

肺癌患者树突状细胞亚型、nk细胞含量与临床病理特征的关系,见表4。按照卡氏评分(<80vs≥80)、化疗史(有vs无)分组,cd11c+dc百分数有极其显著性差异(p<0.01),cd123+dc百分数有显著性差异(p<0.05);按照病理类型(腺癌vs鳞癌)分组cd11c+dc百分数差异有统计学意义(p<0.05);其余分组(性别、年龄、临床分期)之间的各dc亚型百分数比较差异均无统计学意义。而nk细胞的含量仅与年龄相关(p<0.05),同其他临床特征无明显关联(p>0.05)。

3 讨论

3.1 肺癌患者dc亚型的特征

树突状细胞(dc)是一种专职的抗原提呈细胞, 依据 dc起源和功能,将人外周血 dc 分为两个亚群:dc1亚群为髓样细胞来源(myeloid dc),它以 cd11c+dc 前体形式存在于外周血中,在炎症刺激时分化为成熟的 cd11c+ dc, 产生白细胞介素il12, 促进 th1 应答; dc2亚群为淋巴样细胞来源(lymphoid dc), 由其 cd123+dc 前体细胞加 il3 诱导后分化为成熟的淋巴样 dc,不产生 il12,诱导 th2 应答。新鲜分离的外周血 dc 缺乏树枝状的形态学特征,其表面均弱表达或不表达单核细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞及天然杀伤细胞的标记抗原, 但高表达hladr 抗原。因此,将 淋 巴 细 胞 系 列 抗 原 (lin1:cd3、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56的混合体) 表达阴性或弱阳性,hladr表达阳性来初步界定dc群, 再根据 cd11c 和 cd123的表达来确定分别为 cd11c+dc/dc1和 cd123+ dc/dc2。

本次的实验结果表明:肺癌患者外周血cd11c+dc/dc1在白细胞中所占比例低于正常人(p=0.000),而cd123+ dc/dc2在白细胞中所占比例与正常人无显著差异(p=0.829),且cd11c+dc/dc1在数量上比cd123+ dc/dc2占优势,说明肺癌患者dc递呈抗原水平低于正常人,提示肺癌患者机体免疫功能受损,难以促使未成熟dc向mdc分化,不能有效地通过细胞免疫途径杀伤体内的肺癌细胞;而ldc无明显增多,即th2型反应无明显增强,说明体内针对肺癌细胞的体液免疫应答无明显增强。

3.2 肺癌患者dc亚型与nk细胞的关系

树突状细胞(dc)和自然杀伤(nk)细胞是自身免疫系统的两种独特成分,在免疫调节和适应性免疫反应的建立过程中起关键性作用。nk细胞主要通过细胞毒性效应以及产生细胞因子起作用,而dc则识别病原体并向适应性免疫系统发出警报。nk细胞是自体免疫系统中主要的淋巴细胞,通过其细胞因子产物溶解细胞,在免疫监视、免疫防御中起着十分重要的作用,具有体外杀伤肿瘤细胞的功能。

研究表明,dcnk细胞相互作用可导致细胞激活、成熟甚至死亡。fernandez等[8]的早期研究通过证明dc激活nk细胞抗肿瘤活性,首先证实了体内dcnk细胞的相互作用。体外研究表明,nk细胞和成熟dc的接触导致两种细胞的激活和细胞因子的产生,包括nk细胞增殖和dc成熟[911]。dc可以通过各种机制提高nk细胞的生存率,增加nk细胞活性和分化。其中重要的机制之一就是dc分泌的细胞因子,如il12。il12曾一度被称为自然杀伤细胞刺激因子或细胞毒性淋巴细胞分化因子,人体内的dc1可通过分泌il12,促进thl反应,诱导细胞免疫,而il12又可促进dc1的分化、成熟。事实上,人体内的dc能更好地支持nk细胞的存活[12]。成熟的dc还是il12的主要来源,il12可以增加nk细胞介导的细胞毒性和ifnγ产生[13]。

本研究结果显示nsclc患者外周血mdc含量及血浆il12降低,说明nsclc状态下外周血mdc存在il12分泌能力的障碍,从而影响了nk细胞的活性。提示nsclc患者体内不仅存在mdc数量的减少,而且存在nk细胞功能上的缺陷。nsclc患者体内dc产生和功能上的缺陷是肿瘤细胞逃脱机体监视的重要机制之一。另外,检测结果显示,随着cd123+ dc/dc2的百分含量下降,肺癌患者nk细胞含量增高(p=0.018),两者呈显著负相关。本试验证实,dcnk之间的相互作用和通讯,构成了一个正反馈环路,一旦2种细胞中的任何一种细胞感受到了“危险”或组织损伤发生,这一环路将被激活。dcnk细胞之间的相互作用是接触依赖型的,但也同时包括细胞因子之间的交互作用。

3.3 dc亚型与nk细胞之间关系分析的临床意义

由此可见,dc亚型分布情况、nk细胞含量在判断非小细胞肺癌患者病情发展上有一定的临床意义,它们同卡氏评分、是否化疗等临床特征之间均有十分密切的关系。所以,当肺癌发生时,宿主的dc亚群及nk细胞的功能低下、比例失调,导致机体免疫平衡失调。

随着肿瘤患者病情的发展,肿瘤某些生物学特征(机体免疫状态和其他一些生物学指标等)同时发生一些变化,进而提示这些指标之间有一定的相关性。本组研究表明,晚期非小细胞肺癌患者在接受化疗过程中,随着卡氏评分的逐渐降低,机体免疫功能逐渐下降,与此同时,dc各亚型的百分比也明显下降;提示肺癌患者外周血dc亚型与机体免疫状态之间有一种间接的相关性。

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